Микробиологическая диагностика:
Вирусологический метод применяется редко т.к. вирус размножается только в культуре Т-лимфоцитов на сложных средах с добавлением иммуномодулятора – интерлейкина-2.
В практическом здравоохранении чаще применяются серологические методы. ИФА – основной скрининговый метод, который позволяет выявить вирусные антигены и антитела. ВИЧ антитела появляются через 2-4 недели, у некоторых и позже.
Как подтверждающий диагноз тест используют иммуноблоттинг.
Для диагностики ВИЧ инфекции применяют и ПЦР, способную выявлять вирусный генный материал в инкубационном и раннем клиническом периоде, однако ее чувствительность ниже, чем ИФА.
Самостоятельная работа
Схематически изобразить классификацию энтеральных и парентеральных гепатитов.
Зарисовать в тетради схему вириона гепатита В.
Разобрать структуру и химический состав ВИЧ. Зарисовать в тетрадь.
Изучить схему микробиологичекой диагностики ВИЧ- инфекции.
Разобрать методы постановки ИФА, и иммуноблоттинга.
Рис. 8. Схема строения вириона ВИЧ
Указания к самостоятельной работе
Для определения ВИЧ антител разработано множество тест-систем, которые позволяют выявить до 99,9% всех положительных проб. Поставить диагноз на основании только одного ИФА нельзя т.к. хотя и тест специфичный и высокочувствительный, но возможны как ложноположительные так и ложноотрицательные результаты. В зависимости от используемых тест-систем средняя частота ложноотрицательных результатов 1:1000, а ложноположительных – 1:10000. Для подтверждения диагноза необходимо использовать иммуноблот (Вестернблот), который заключается в разделении белков ВИЧ с помощью иммуноэлектрофореза с последующим определением антител к белкам gp 41, gp 120, p 24.
ИФА иммуноферментный метод, выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сыворотко в смесь добавляют субстрат/ хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, и изменяется цвет прдукта реакция- интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.
Твердофазный ИФА – наиболее распространенный вариант иммунологического теста, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антиела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках планшеток из полистерола. При определении антител в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, и субстратом, и субстрат (хромоген) для фермента. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а затем субстрата для фермента.
Метод иммуноблоттинга (ИБ)- высокочувствительный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА.
Антиген выделяют с помощью электрофореза с полиакриламидном геле, затем переносят его (блоттинг - от англ. blot. пятно) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоска с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченую ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс антиген+ антитело больного+ антитело против Ig человека выявляют довалением субстрата хромогена, изменяющего окраску под действием фермента. ИБ используют как дагностический метод при ВИЧ – инфекции и др.
Таблица №35