Микробиологическая диагностика энтеровирусных инфекций.
Лабораторный диагноз полиомиелита может быть поставлен на основании:
1. Вирусологического метода - обнаружение вируса в испражнениях больного или носителя путем заражения первичных культур почек обезьян, клеток HELA и др.,
2. Иммунноиндикации – обнаружение антигена вируса в носоглоточном смыве с помощью ПЦР, ИФА и РИМ.
3. Серологической диагностики - используется РБН (реакция биологической нейтрализации методом «цветной пробы»), РСК, ИФА, обнаружение противовирусных антител с помощью реакции преципитации.
Самостоятельная работа студентов:
Изучить и зарисовать схему микробиологической диагностики энтеровирусных инфекций (полиомиелита, вирусов Коксаки, ECHO и др.).
Зарисовать в тетради модель строения вириона полиомиелита, обозначить на рисунке НК, капсид, капсомеры, нуклеокапсид.
Изучить результаты идентификации энтеровирусов в реакции нейтрализации со специфическими иммунными сыворотками. Дать заключение. Зарисовать в тетради схему РБН (реакция биологической нейтрализации) для идентификации вируса.
Оценить результаты титрования вируснейтрализующих антител в РБН парными сыворотками. Дать заключение.
Разобрать схему обнаружения противовирусных антител или антигенов с помощью реакции преципитации.
Указания к самостоятельной работе:
1. Схема микробиологической диагностики энтеровирусных инфекций (таблица).
2. Обнаружение вируса в культуре ткани методом «цветной пробы». В основу «цветной реакции» положено, то обстоятельство, что в процессе размножения и роста клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты обмена веществ, сдвигающие рН среды, в кислую сторону. В ткани, зараженной вирусом, наступает дегенерация клеток, метаболизм их подавляется и не происходит изменения рН среды. Для выявления этих изменений в питательную среду добавляют индикатор феноловый. При рН выше 7 цвет индикатора красный, при рН 7- оранжевый, рН ниже 7- желтый. Если клетки не заражены вирусом (или он нейтрализован специфической сывороткой), то рН питательной среды сдвигается в кислую сторону, и она становится желтой. Если вирус размножается, то клетки дегенерируют и среда сохраняет исходный красный цвет.
Таблица №33
3. Схема определения титра антител методом цветной пробы
|
Ингредиент |
Разведение сыворотки |
Контроль | |||||||
|
1:4 |
1:8 |
1:16 |
1:32 |
1:64 |
Токсичности сыворотки |
Роста клеток |
Роста вируса | ||
|
Сыворотка, мл Вирус, мл |
0,25 0,25 |
0,25 0,25 |
0,25 0,25 |
0,25 0,25 |
0,25 0,25 |
0,25 - |
- - |
- 0,25 | |
|
40 минут при комнатной температуре для нейтрализации вируса | |||||||||
|
Клеточная суспензия, мл |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 | |
|
Вазелиновое масло, мл |
По 0,4 во все пробирки Термостат 370 3-7 дней | ||||||||
|
Результат: Пожелтение цвета среды свидетельствует о нейтрализации вируса антителами сыворотки | |||||||||
4. Обнаружение противовирусных антигенов с помощью реакции преципитации. Реакция преципитации в агаре широко используется для диагностики вирусных заболеваний (полиомиелита, Коксаки и др.) Реакция может быть поставлена в чашках Петри, на предметных стеклах и в капиллярах.
Постановка реакций преципитации на предметных стеклах для выявления антигена вируса полиомиелита.
На обычные предметные стекла наносят 2 мл расплавленного и охлажденного до 60º агара (I % - ый агар на физиологическом растворе с 1:20000 мертиолята). Толщина слоя агара на стекле составляет около I мм. После застывания агара в нем вырезают лунки диаметром 3-4мм с расстоянием между центрами луночек 5-6 мм. Количество луночек и их расположение на стекле могуть быть различными в зависимости от условий опыта. Объем используемых ингредиентов 0,02 мл. Реакция ставится с несколькими контролями. Для определения антигена вируса вырезают 4 лунки (см. схему) и каждую из них наливают соответственно следующие ингредиенты: специфическая сыворотка, специфический антиген, нормальная сыворотка, искомый антиген. Если искомый интиген соответствует сыворотке, то между соответствующими луночками должна появиться линия преципитации. Линия преципитации должна также появиться между лунками со специфической сывороткой и специфическим антигеном.
Преципитация наблюдается через 4-5 часов инкубации в термостате во влажной камере.
Схема постановки реакции преципитации в агаре для выявления вирусного антигена (рис. 7).
Сс - сыворотка специфическая; Сн - сыворотка нормальная;
Ас - антиген специфический; Аи - антиген искомый.
Рис.№7. Реакция преципитации для обнаружения противовирусных антигенов
Таблица №34