Технология получения культуры гепатоцитов пригодной для использования в системе экстракорпоральной детоксикации крови «биоискусственная печень»

Стасюк А.А. (6-й курс, леч. ф-т), Дубасов А.Ю. (3-й курс, леч. ф-т), Лукин М.О. (2-й курс леч. ф-т)

ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России

Кафедра биологической химии

Научные руководители – д.б.н., проф. Рябинин В.Е., к.б.н., ст. преп. Пушкарёв С.А., ст. преп. Попков П.Н.

В последние два десятилетия благодаря прогрессу биотехнологии, молекулярной и клеточной биологии мощное развитие получили клеточная и тканевая инженерия. Одним из важнейших направлений развития этих отраслей является разработка систем искусственного жизнеобеспечения, использующих зрелые, фетальные или стволовые клетки, таких как аппарат «Биоискусственная печень». Внедрение в клиническую практику подобных систем, позволило бы сохранить жизнь пациентов, ожидающих донорскую печень, а в ряде случаев полностью устранить потребность в трансплантации [Рябинин В.Е. и др., 2003].

Перспективной разработкой является система экстракорпоральной детоксикации крови «Биоискусственная печень», созданная под руководством профессора В.Е. Рябинина. В экспериментальных исследованиях было показано, что использование способа очистки крови от токсинов с использованием цитозоля печени свиней, приводит к снижению уровня эндотоксемии и нормализации обменных процессов [Гробовой С.И. и др., 2003].

Следующим шагом в исследованиях, направленных на усовершенствование аппарата «Биоискусственная печень», является создание системы детоксикации, использующей живые функционально активные клетки печени. В соответствии с поставленной целью, настоящее время в нашей лаборатории ведётся разработка технологий, позволяющих внедрить полученные от экспериментальных животных гепатоциты в биореактор с минимальной потерей в жизнеспособности и функциональной активности используемых клеток.

В рамках данной работы нами освоена техника выделения гепатоцитов крысы путём двухэтапной перфузии печени по методу Сеглена [Seglenetal., 1976] c некоторыми модификациями [Shamuleau, 2005]. Была отработана технология получения монослойной культуры гепатоцитов. Разработан комплекс методов оценки функциональной активности и жизнеспособности клеток. Создана экспериментальная установка для проведения модельных экспериментов по детоксикации плазмы крови с помощью суспензии гепатоцитов крысы. Ведётся работа по созданию прототипа биореактора, включающего мембранный картридж с клетками, иммобилизованными в коллагене.

Применённые методы позволили получить из печени одной крысы в общей сложности около 1 × 10⁸клеток, что сопоставимо с количествами, указываемыми в ряде литературных источников [Seglenetal., 1976;Baderetal. 1999].

Клетки в полученной культуре по своей морфологии соответствовали описаниям и микрофотографиям приводимым в литературных источниках [Seglenetal., 1976].

В полученных культурах наличие жизнеспособных клеток имело место в течение 96 ч. инкубации. В суспензии гепатоцитов, использованной в модельном эксперименте по детоксикации плазмы крови жизнеспособные клетки сохранялись до 3 ч.

Таким образом, в ходе работы нам удалось добиться показателей выхода клеток, а так же их выживаемости в монослойной культуре, сопоставимых с литературными данными. Достигнутые результаты позволят нам в дальнейшем эффективно выделять клеточный материал, а так же поддерживать его жизнеспособность и функциональную активность, на уровне достаточном для использовния в составе усовершенствованной системы экстракорпоральной детоксикации крови «Биоискусственная печень».