3. Метод Фортнера

Біологічний спосіб культивування анаеробів (метод Фортнера), або метод спільного культивування анаеробів і аеробів на щільних живильних середовищах у запаяних чашках Петрі. На поверхню середовища в чашках Петрі (5% кров'яний агар з 1–2% глюкози), розділеної на дві половини жолобком, висівають на одній половині культуру, яка активно поглинає кисень, аероби (S. marcescens або E. coli), на іншій половині – досліджуваний матеріал. Чашки запаюють воском або заклеюютьлейкопластиром. Аеробні бактерії швидко використовують кисень в герметично закритій чашці, що створює умови для зростання анаеробів. Метод дозволяєвиділяти деякіClostridium spp.

4. Ріст Cl. Perfingens на середовищі Вільсон-Блера

На цьому середовищі C. perfringens утворює почорніння та розрив агару. Ріст C. perfringens відбувається в глибині агару. При цьому відбувається відновлення сірчистокислого натрію до сульфіду, останній вступає в реакцію з хлористим залізом, переводячи його в сульфід заліза, який має чорний колір. Розрив поживного середовища пов'язанийіз розщепленням глюкози з виділенням газу.

Рисунок 51 – РістC. perfringensна середовищі Вільсона-Блера

5. Метод Віньяла-Вейонапростий та доступний для будь-якої лабораторії. Готують розведення ґрунтової завbсі в декількох пробірках з 0,5% розплавленим і охолодженим до 45 °С агаром, потім вміст кожної пробірки набирають в пастерівську піпетку, заповнюючи всю піпетку. Після заповнення витягнутий кінець піпетки запаюють і поміщають у скляний циліндр та ставлятьутермостат. Через 2–3 доби у стовпчику агару виростають помітні колонії мікроорганізмів-анаеробів. Щоб вирощену колонію витягнути, запильником роблять надріз вище рівня поміченої колонії, надломлюють, а колонію мікроба, що знаходиться в агарі, витягують петлею та пересівають у свіже рідке поживне середовище.

6. Clostridium tetani, фарбування за Цілем-Нільсеном. Зверніть увагу на спори червоного кольору і вегетативну частину клітини синього кольору. Палички зі спорами порівнюють з барабанними паличками, бо ці бактерії утворюють термінальну круглу спору, діаметр якої перевищує діаметр вегетативної клітини.

Рисунок 52 – РістC. tetani, фарбування заметодом Ціля-Нільсена

7. Clostridium perfringens, фарбування за Грамом. Грампозитивні палички. Ці бактерії мають великі овальні спори, частіше – субтермінальні. При фарбуванні за Грамом бактерії та оболонка спори забарвлені в фіолетовий колір. Центральна частина спори не забарвлена.

Рисунок 53 – C. perfringensфарбування за Грамом

Робота 2. Провести ІІ етап виділення чистої культури анаеробних бактерій з ґрунту

Однією з основних вимог щодо культивування анаеробних бактерій є створення анаеробної атмосфери, видалення кисню з поживного середовища і зниження її редокс-потенціалу та з атмосферного простору, в якому культивують анаеробні мікроорганізми. Тому на першому етапі виділення чистої культури анаеробних бактерій був зроблений посів матеріалу – ґрунт, розведений у фізіологічному розчині 1:10 на середовище Кітта-Тароцці. На дно пробірки для поглинання кисню помістили шматочки печінки. Середовище перед посівом прогріли на киплячій водяній банівпродовж10 – 20 хвилин (для видалення розчинного в ній кисню), а потім охолодили. Оскільки метоюцього дослідження є виділення спорових форм анаеробних бактерій, засіяне середовище зновупрогріли при температурі 80°Супродовж20 – 30 хвилин для знешкодження неспорових форм бактерій. Посіви залили вазеліновим маслом та інкубували в термостаті.

На другому етапі ви повинні охарактеризувати зміни, що виникли в середовищі накопичення: помутніння або помутніння та газоутворення. Крім того, ви повинні виготовити фіксований препаратіз посіву зависі ґрунту та пофарбувати його за Грамом. Результати занесіть до протоколу. Приготування препарату проведіть затакою методикою: бульйонну культуру наберіть пастерівською піпеткою, яку опустіть через шар вазелінового масла до дна пробірки. Мазки готуйте на склі звичайним способом, зафіксуйте в полум’ї та пофарбуйте за Грамом. При мікроскопії зверніть увагу на морфологічні ознаки спороутворюючих та споронеутворюючих анаеробів (наявність великих грампозитивних паличок дозволяє запідозритинаявністьу матеріалі клостридій). Слід зауважити, що на другому етапі проводиться пересівіз середовища Кітта-Тароцці на спеціальні щільні поживні середовища для анаеробів.