Демонстрація

1. Реакція непрямої гемаглютинації (рнга)

У цій реакції, антиген адсорбований на поверхні еритроцитів (еритроцитарний діагностикум), аглютинує зі специфічними антитілами (імунна сироватка). При позитивній реакції утворюється аглютинат у вигляді парасольки на дні лунок, у той час як у контролі без імунної сироватки, еритроцити осідають у центрі, утворюючи «ґудзик» із рівними краями. Реакція непрямої гемаглютинації є більш чутливою, ніж аглютинація бактерій, застосовується для діагностики при багатьох інфекційних захворюваннях, особливо у дітей, за необхідності виявлення антитіл у більш низьких титрах. Ця реакція може бути використана і для виявлення антигенів при застосуванні антитільних діагностикумів.

Рисунок 76 – Реакція непрямої гемаглютинації

2. Реакція преципітації в гелі

Для визначення токсигенності дифтерійних культур на чашку з агаром поміщається смужка фільтрувального паперу, змочена антитоксичною сироваткою, що містить у 1 мл 500 МО, потім роблять посів дифтерійних культур бляшками на відстані 1 см від краю смужки. Якщо культура продукує екзотоксин, він дифундує в живильне середовище і дає утворення преципітату з антитоксичною сироваткою у вигляді тонких ліній.

Рисунок 77 – Реакція преципітації в гелі

3. Антигени для РЗК можуть бути білкові або полісахаридні антигени мікроорганізмів, бактеріальні клітини, віруси, екстракти органів і тканин.

4. Комплемент являється собою свіжу або ліофілізовану сироватку морської (гвінейської) свинки, яку розводять 1:10. Титрують комплемент у день постановки РЗК.

5. Гемолітична сироватка готується шляхом імунізації кролів овечими еритроцитами, титрується і використовується у потрібному титрі з еритроцитами барана.

6. Люмінесцентні сироватки використовуються для експрес-діагностики в реакції імунофлюоресценції. При проведенні реакції досліджувальний матеріал фіксують на предметному склі, потім наносять мічену сироватку зі специфічними антитілами і через 30–40 хвилин обережно змивають водою, сушать і мікроскопіюють за допомогою люмінесцентного мікроскопа. Якщо утворився комплекс антитіл із антигеном (мікробом), то в полі зору видно мікроорганізми, які світяться, наприклад, палички збудника.

Пояснення до самостійної роботи з теми «серологічні реакції: реакція зв’язування комплементу (рзк), реакції з використанням мічених антитіл та антигенів – іфа, ріф, ріа»

Принципи та цілі проведення серологічних реакцій	Серологічні реакції використовуються для визначення специфічних антитіл (серодіагностика) та антигенів (сероідентифікація). Усі серологічні реакції базуються на взаємодії антиген-антитіло та відбуваються у дві фази: специфічну та неспецифічну. Під час специфічної фази відбувається специфічне зв’язування активного центра антитіла з відповідною антигенною детермінантою. Потім розпочинається неспецифічна фаза, яка проявляється у вигляді різноманітних фізичних явищ – утворення аглютинату, преципітату та інше). Залежно від техніки проведення та отриманого результату всі реакції поділяють на прості та складні. Прості реакції базуються на взаємодії лише на використанні антигену та антитіл. До них належать реакції аглютинації, преципітації. Складні базуються на використанні специфічних (антигенів та антитіл) та додаткових компонентів (допомагають візуалізувати результати реакції). Прикладом складних реакцій є РЗК, ІФА, РІФ, РІА
Діагностичний препарат для виявлення Аг	Імунна діагностична сироватка, яка містить специфічні антитіла до конкретного Аг
Діагностичні імунні сироватки	У більшості випадків це антимікробні сироватки (наприклад, проти сальмонел, але можуть бути використані і антитоксичні (наприклад, протидифтерійна для визначення токсигенності збудника), які частіше використовують для лікування і профілактики
Одержання діагностичних сироваток	Імунізація тварин (кроликів) відповідними мікробами або їх антигенами
Метод діагностики для виявлення специфічних антитіл	Серологічний метод
Титр антитіл	Титр антитіл – найбільше розведення сироватки, де ще відбувається позитивна реакція
Діагностичний препарат для виявлення Ат	Діагностикум, або Аг (наприклад, у реакції зв'язування комплементу)
Компоненти реакції аглютинації для визначення виду бактерій (бактеріологічний метод)	Чиста культура бактерій, яка вивчається. Видова діагностична сироватка. 3. Електроліт (фізіологічний розчин)
Феномен аглютинації	Відбувається, коли антитіла сорбуються на мікробних клітинах або на інших корпускулярних антигенах, які під впливом антитіл склеюються в агрегати (аглютинати)
Аглютиніни	Антитіла, які беруть участь в реакції аглютинації
Аглютиногени	Антигени, які беруть участь в реакції аглютинації
Практичне використання реакції аглютинації	Серологічна діагностика інфекційних захворювань та інших патологічних станів, шляхом визначення специфічних антитіл в сироватці крові або в інших рідинах організму. Ідентифікація антигенів бактерій при бактеріологічному методі діагностики інфекційних захворювань
Способи постановки реакції аглютинації	Пластинчата реакція аглютинації ставиться на скляних або фарфорових пластинках з гладкою поверхнею, для визначення антигенної структури збудника. Розгорнута реакція аглютинації ставиться в пробірках або в лунках полістеролових планшетів з послідованими розведеннями сироватки, в які вносять однакову кількості антигена, з наступним визначенням титру антитіл
Реакція преципітації (РП) (механізм) Преципітуючі сироватки	РП характеризується взаємодією розчинного антигену (преципітиногену) і антитіла (преципітину) за наявності електроліту (0,85% розчин NaCl). При позитивній реакції відбувається агрегація антигену, що проявляється помутнінням прозорої рідини і випадінням осаду (преципітату). Осад комплексів антиген-антитіло із розчину відбувається в діапазоні еквівалентних співвідношень концентрацій взаємодіючих молекул. РП є більш чутливою порівняно з реакцією аглютинації та дозволяє виявити специфічний антиген у дуже малих концентраціях. Тому реакції преципітації використовуються головним чином з метою визначення антигену
Різновиди РП	РП у рідині відбувається при змішуванні розчинів антигену й антитіла або нашаруванні одного компонента на інший. В останньому варіанті на межі двох реагентів утворюється преципітат у вигляді кільця. Така реакція одержала назву реакції кільцепреципітації. Реакцію проводять у вузьких пробірках з 0,1 – 0,5 мл реагентів. Для визначення антигенів використовують реакцію преципітації або дифузії в гелях агару або агарози. Суть реакції полягає в тому, що антиген і антитіло дифундують в порах гелю на зустріч один одному, взаємодіють між собою і утворюють комплекс, який осаджується у вигляді лінії преципітації. Діагностичну преципітуючу сироватку готують шляхом імунізації кролів розчином антигену за спеціальною схемою. Одержану імунну сироватку титрують в реакції преципітації. Титром сироватки є найбільше розведення антигену, де ще утворюється преципітат
Практичне використання РП	РП використовується: для діагностики ряду інфекційних захворювань – сибірки, чуми, туляремії, епідемічного цереброспінального менінгіту та інші. Як антигени використовують екстракти уражених органів, ліквор та інше, а як антитіла (преципітини) – діагностичні преципітуючі сироватки. РП використовується також для визначеня класів імуноглобулінів та для вивчення антигенної структури бактерій. Крім того, для визначення видової належності білків, зокрема білків крові в судовій практиці
Компоненти реакції зв'язування комплементу (РЗК), яка використовується для виявлення антитіл	1. Сироватка особи, яка обстежується (пошук антитіл). 2. Антиген. 3. Комплемент. Гемолітична система: 4. Гемолітична сироватка. 5. Овечі еритроцити (3% суспензія)
Пряма реакція імунофлуоресценції (РІФ)	Пряма РІФ ґрунтується на тому, що мікроби або антигени тканин, до яких додані імунні сироватки зі специфічними антитілами, міченими флуорохромами, починають світитися зеленим світлом в УФ-променях люмінесцентного мікроскопа. Бактерії в препараті на склі, обробленому такою сироваткою, світяться по периферії клітини у вигляді облямівки зеленого кольору
Компоненти РІФ для виявлення антигенів (експрес-діагностика)	1. Матеріал від хворого або культура мікроорганізмів. 2. Специфічна люмінесцентна сироватка (мічені антитіла). 3. Люмінесцентний мікроскоп
Непряма реакція імунофлуоресценції (РІФ)	Непряма РІФ ґрунтується на виявленні комплексу антиген-антитіло за допомогою антиглобулінової сироватки, міченої флуорохромом. Спочатку на мазок із фіксованими на склі мікроорганізмами наноситься антимікробна кроляча діагностична сироватка, яка містить немічені специфічні антитіла, щоб відбулася реакція антиген-антитіло. Такі препарати необхідно помістити у вологу камеру на 40 хвилин. Антитіла, які не зв’язалися з антигенами мікроорганізмів, відмиваються водою. На препарат наноситься антиглобулінова (антикроляча) сироватка, мічена флуорохромом. Знову препарат поміщається у вологу камеру, потім промивається водою і проводиться мікроскопія в люмінесцентному мікроскопі, як і при прямому методі РІФ. Якщо в досліджуваному препараті знаходяться збудники (мікроорганізми), які є специфічними до доданих немічених антитіл, то відбувається реакція антиген-антитіло (антитіла сорбуються на поверхні фіксованих мікроорганізмів). Утворений комплекс виявляється за допомогою мічених флуорохромом антикролячих антитіл, які сорбуються на повехні першого комплексу антиген-антитіло. Комплекс антиген-антитіло-антиглобулін, що утворився, легко виявляється у люмінесцентному мікроскопі. Реакція імунофлуоресценції широко використовуються в медичній прктиці особливо для прискореної, експрес-діагностики інфекційних захворювань
Компоненти реакції непрямої імунофлуоресценції для виявлення антигенів (експрес-діагностика)	1. Матеріал, який досліджується. 2. Специфічна сироватка (немічені антитіла). 3. Антиглобулінова люмінесцентна сироватка (мічені кролячі антитіла). 4. Люмінесцентний мікроскоп
Імуноферментний метод або аналіз (ІФА)	Імуноферментний аналіз (ІФА) базується на виявленні антигенів за допомогою специфічних антитіл, кон’югованих (з’єднаних) із ферментом-міткою (пероксидазою хрону або лужною фосфатазою). Після з’єднання антигену з міченою сироваткою в суміш додається субстрат (хромоген), наприклад Н2О2. Субстрат розщеплюється ферментом, а продукти його деградації викликають хімічну модифікацію хромогену, що викликає зміну забарвлення реагуючої суміші. Інтенсивність забарвлення прямо пропорційна концентрації антигену або антитіл, які взяли участь в реакції, тобто прореагували. Твердофазний ІФА-найбільш поширений варіант даного методу, коли один із компонентів імунної реакції (антиген або антитіла) сорбований на твердому носії, наприклад, у лунках планшета із полістеролу. При визначенні антитіл у лунки планшета з сорбованим антигеном послідовно додається сироватка крові хворого, антиглобулінова сироватка, мічена ферментом, і субстрат (хромоген) для фермента. Кожен раз після додавання наступного компонента незв’язані реагенти видаляються із лунок шляхом ретельного промивання. При позитивному результаті змінюється колір хромогену. На твердофазному носії можно фіксувати не тільки антиген, а й антитіла. В цьому випадку в лунки з сорбованими антитілами додається досліджуваний антиген, імунна сироватка, мічена ферментом, а потім хромоген
Компоненти ІФА для виявлення антитіл	1.Антиген на твердій фазі. 2.Сироватка крові особи, яка обстежується (пошук антитіл). 3.Антиглобулінова сироватка, мічена ферментом (пероксидазою). 4.Субстрат для ферменту з індикатором (хромоген)
Радіоімунний метод або аналіз (РІА)	До радіоімунних методів відносять методи, в яких застосовують мічені радіоактивними ізотопами антигени або антитіла. Як радіоактивну мітку найчастіше використовують тритій – Н^3 і йод – J^125. Радіоактивність вимірюють за допомогою лічильника γ-проміння. Інтенсивність випромінення відображує концентрацію міченого антигену чи антитіла. Класична радіоімунна методика базується на використанні конкурентного зв’язування антитілами досліджуваного антигену і міченого ізотопом антигену, який вносять у конкретну пробу в тій самій кількості. Чим більше кількість досліджуваного антигену, тим менше міченого антигену зв’язується з антитілами. Принцип конкурентного РІА полягає в тому, що спочатку антитіло, фіксоване на твердій фазі, поєднують з дослідним матеріалом, у якому визначають антиген, потім додають мічений ізотопом стандартний антиген. За наявності в матеріалі специфічного антигену меншою мірою буде зв’язуватися з антитілом мічений антиген, про що буде свідчити низька радіоактивність у пробі. Радіоімунні методи належать до найчутливіших імунологічних методів, які дозволяють виявляти дуже малі кількості антигену (нано-, пікограми). Але для їх виконання необхідні відповідні специфічні умови, які дозволяють проведення робити з радіоактивними ізотопами
Імуноелектрофорез	Імуноелектрофорез є поєднанням двох методів – електрофорезу в гелі та імунодифузії. Цей метод дозволяє розділяти молекули за електрофоретичною рухливістю (між анодом і катодом) та ідентифікувати їх (за антигенною специфічністю за допомогою гомологічних імунних сироваток). Спочатку з сумішшю антигенів проводиться електрофорез, частіше в агаровому гелі. Потім паралельно лініям руху антигенів вирізається канавка, в яку вноситься гомологічна антисироватка. В результаті дифузії антигени і антитіла мігрують в порах носія (агарового гелю) назустріч один одному, з'єднуються в зонах еквівалентності їх концентрацій і утворюють дугоподібні лінії преципітації, кількість, розташування і форми яких дають уявлення про кількісний і якісний склад досліджуваної суміші антигенів
Проточна цитофлуориметрія	Проточна цитометрія є сучасною технологією швидкого оптичного вимірювання параметрів клітини, її органел та процесів, які в ній відбуваються. Методика базується на виявленні розсіяного світла лазерного променя при проходженні через нього клітини в потоці рідини, причому ступінь світлової дисперсії дозволяє отримати уявлення про розміри та структури клітини. Клітинна суспензія, попередньомічена флюоресціюючими моноклональними антитіламиабофлуоресцентнимибарвниками, потрапляє у струмінь рідини,що проходить черезкомірку. Умовипідібранітакимчином,що клітинишикуються одна заодною (гідродинамічнефокусування струменя в струмені).Умомент пересіканняклітиною лазерногопроменя детекторифіксують різні показники, які дозволяють визначити субпопуляційнийскладклітинноїсуспензії