Набутий (адаптивний) імунітет

Гуморальний

Місцевий (SIgA, IgE)

Загальний (IgG IgM IgE IgA IgD)

Загальний (IgM, G, A, E)

антитоксичний

антибактеріальний

протигрибковий

противірусний

протигельмінтний

протипаразитарний

протипухлинний

трансплантаційний

Клітинний:

Цитоксичний (Ткілери)

Запальний (Th₁)-CD₄

Активовані макрофаги

Рисунок 72 – Структура антитіл

15. СЕРОЛОГІЧНІ РЕАКЦІЇ: АГЛЮТИНАЦІЇ, ПРЕЦИПІТАЦІЇ,

РЗК, ІФА, РІФ, РІА

Актуальність теми: серологічні реакції використовуються в сучасній медичній практиці для діагностики інфекційних та ряду соматичних захворювань, а також для оцінки ефективності лікування та профілактики.

Мета загальна – знати цілі, з якими проводяться серологічні реакції в медичній практиці, та уміти оцінювати їх результати.

ТЕОРЕТИЧНІ ПИТАННЯ

1. Приципи та цілі проведення серологічних реакцій у медичній практиці.

2. Реакція аглютинації, механізми, різновиди, практичне використання.

3. Реакція преципітації: визначення, механізм, різновиди, практичне використання.

4. Аглютинуючі та преципітуючі сироватки: приготування, титрування, практичне використання.

5. Реакція зв’язування комплементу (РЗК): цілі постановки, компоненти, механізми.

6. Реакція імунофлюоресценції (РІФ): різновиди, мета постановки, компоненти, механізм.

7. Імуноферментний аналіз (ІФА): цілі постановки, компоненти, механізм.

8. Радіоімунний аналіз (РІА): мета проведення, компоненти, механізм.

Практична робота

Робота 1. Виконати реакцію аглютинації на склі для визначення антигенних властивостей бактерій. Приготувати препарат із аглютинату, пофарбувати фуксином, мікроскопіювати

На предметне скло нанести краплю аглютинуючої сироватки у розведенні 1:10 – 1:20, поруч краплю фізрозчину для контролю. Петлею візміть невелику кількість культури зі скошеного агару і рівномірно емульгуйте її у фізрозчині та сироватці. При позитивній реакції аглютинації з’являються пластівці, а контрольна крапля фізрозчину залишається рівномірно мутною.

Рисунок 73 – Реакція аглютинації на склі

Робота 2. Оцінити результати розгорнутої реакції аглютинації, проведеної для серологічної діагностики бруцельозу

Для визначення титру протибруцельозних антитіл у реакції розгорнутої аглютинації візьміть 6 пробірок. У першу пробірку внесіть 1 мл вихідного розведення сироватки (1:50). В усі 6 пробірок внесіть по 1 мл фізіологічного розчину. У першій пробірці одержимо розведення сироватки 1:100 при об’ємі 2 мл. З першої пробірки 1 мл перенесіть у другу пробірку, де розведення стане 1:200. Так зробіть ряд послідовних розведень сироватки в 5 пробірках (1:100, 1:200, 1:400, 1:800). З п’ятої пробірки 1 мл вилийте в дезрозчин. У всі 5 пробірок додайте по 2 краплі бруцельозного діагностикуму. Шоста пробірка є контролем діагностикуму (містить фізіологічний розчин і діагностикум). Такий контроль необхідний для виключення спонтанної аглютинації культури. Пробірки струшують і поміщають у термостат при температурі 37° на 2 години, а потім залишають на добу при кімнатній температурі, після чого роблять облік результатів реакції аглютинації.

Рисунок 74 – Розгорнута реакція аглютинації

Агглютинація Контроль Контроль

сироватки антигена

Робота 3. Виконати реакцію кільцепреципітації для визначення видової належності кров’яної плями. Записати в протокол хід реакції, провести облік результатів, зробити висновок

Для визначення видової належності кров'яної плями проводять реакцію кільце-преципітації. Для цього у вузькі пробірки наливають преципітуючу сироватку проти білка крові людини, преципітуючу сироватку проти білка крові барана, фізіологічний розчин. Потім обережно по стінці пробірки за допомогою тонкої пастерівської піпетки нашаровують екстракт кров’яної плями. При правильному нашаровуванні повинно бути чітко видно межу між антигеном та сироваткою. Реакцію враховують після інкубації у термостаті пробірок упрдовж 30 хвилин, при температурі 25–26 ^°С. При позитивному результаті на границі двох рідин утворюється щільне біле кільце. Проведіть облік результату реакції, внесіть його у протокол.

Антигени

Преципітат

Рисунок 75 – Реакція кільцепреципітації

Робота 4. Переглянути результати реакції зв’язування комплементу (РЗК) з метою серологічної діагностики кашлюку, зробити висновок

Реакцію проводять у 3 пробірках. Відтитровані інгредієнти (антиген, комплемент, гемолітична сироватка) розводять фізіологічним розчином таким чином, щоб робоча доза їх містилася в 0,5 мл. Одночасно готують 3% суспензію овечих еритроцитів. У допоміжних пробірках розводять інактивовану прогріванням (56 ^°С – 30 хвилин) досліджувану сироватку. При постановці реакції спочатку змішують досліджувану сироватку, антиген і комплемент. Суміш витримують при температурі 37 ^°С упродовж 40 хвилин. Після зазначеного терміну в пробірку додають гемолітичну систему (2 мл гемолітичної сироватки + 2 мл 3% суспензії еритроцитів). Пробірки знову струшують та ставлять у термостат при 37 ^°С. Облік результатів реакції проводять після того, як відбудеться повний гемоліз у пробірках із контролем сироватки і контролем антигену.

Результати реакції визначають за наявністю чи відсутністю гемолізу у дослідній пробірці. Реакцію вважають позитивною при повній затримці гемолізу, коли рідина в пробірці безкольорова і еритроцити осідають на дно, а негативною – при повному лізисі еритроцитів, коли рідина інтенсивно забарвлена («лакова кров»). Ступінь затримки гемолізу оцінюють залежно від інтенсивності забарвлення рідини і розміру осаду еритроцитів на дні ( ++++, +++, ++, +).

РЗК належить до непрямих двосистемних реакцій, яка використовується для серологічної діагностики (визначення в крові специфічних комплементзв’язуючих антитіл) за допомогою відомого антигену або визначення антигенів за допомогою відомих антитіл.

Якщо в досліджуваній сироватці є специфічні до даного антигену антитіла, то утворюється комплекс антиген+антитіло, який приєднує до себе комплемент. Але цей процес є непомітним візуально. Для того щоб визначити, в якому стані знаходиться доданий комплемент (зв’язаний чи незв’язаний), додається друга система, яка називається індикаторною. Гемолітична система готується перед постановкою реакції і складається з гемолітичної сироватки, яка містить антитіла проти овечих еритроцитів (гемолізини) та еритроцити барана (ЕБ). Імунна реакція гемолізу в цій системі відбувається за наявності незв’язаного в першій системі комплементу.

Як комплемент у РЗК використовується сироватка морської (гвінейської) свинки. Усі компоненти РЗК, за винятком досліджуваної сироватки, попередньо титруються і використовуються в робочій дозі.

У тому випадку, коли в досліджуваній сироватці є специфічні антитіла, утворюється комплекс антиген+антитіло, який через Fc-фрагмент антитіл зв’язує комплемент, але це візуально не помітно. Тому додається до цієї суміші гемолітична система, і якщо комплемент зв’язаний у першій системі, то гемоліз у другій системі не відбувається, реакція позитивна – ЕБ знаходяться в осаді. У тому випадку, коли в досліджуваній сироватці антитіла відсутні, комплемент залишається в першій системі незв’язаним, вільним, і коли додається друга (гемолітична) система, відбувається гемоліз еритроцитів, що свідчить про те, що РЗК негативна. РЗК використовується для діагностики сифілісу, туберкульозу, бруцельозу, кандидозу, грипу та інших захворювань.

Робота 5. Вивчити і записати у протокол демонстрацію з висновками