V етап Врахування та аналіз результатів дослідження. Відповідь

9. Бактеріофаги. Генетика бактерій

Актуальність теми: вивчення генетики бактерій та бактеріофагів необхідне для знання механізмів передачі патогенних властивостей і стійкості мікроорганізмів до лікарських препаратів. Генетичні маркери мікроорганізмів використовуються для діагностики інфекційних захворювань.

Мета (загальна) – уміти використовувати у медичній практиці бактеріофаги та оцінювати результати генетичних методів діагностики.

Теоретичні питання

1. Природа та властивості бактеріофагів.

2. Вірулентні та помірні фаги. Механізми їх взаємодії з бактеріальною клітиною. Практичне використання бактеріофагів (фагоідентифікація, індикація, профілактика, терапія).

3. Форми мінливості мікроорганізмів. Фенотипова мінливість.

4. Основні принципи генної інженерії.

5. Форми прояву мінливості мікроорганізмів.

6. Організація генетичного апарату бактерії.

7. Генетичні рекомбінації бактерій: трансформація, трансдукція, кон’югація.

8. Плазміди та їх характеристики (R-,F-,Col,Tain).

9. Фенотипова мінливість. Значення в мікробіологічній діагностиці інфекційних захворювань. L-форми бактерій.

10. Роль мутацій, рекомбінацій, селекції в мінливості стійких до ліків форм бактерій.

11. Генна інженерія, практичне використання в медичній мікробіології. Принципи генетичних методів діагностики інфекційних захворювань: ПЛР, ДНК-зондування.

Практична робота студентів

Робота 1. Вивчити та зарисувати демонстрацію, результати внести у протокол

Демонстрація

1. Реакція наростання титру фага

Принцип цієї реакції полягає у тому, що до дослідного матеріалу додають певну кількість індикаторного (специфічного) фага і ставлять утермостат. Якщо в дослідному матеріалі знаходяться бактерії, що відповідають внесеному фагу, кількість корпускул фага збільшується, у протилежномувипадкутитр бактеріофага буде дорівнювати вихідному.

Результат реакції занесіть до протоколу, зробіть висновок.

2. Титрування бактеріофага за методом Граціа

Титрування фага за Граціа дозволяє провести точне врахування активності препарату, тобто кількість фагових часток у1 мл досліджуваної рідини.

Цей метод полягає у наступному. До бульйонної культури стафілокока (0,5мл) додаємо 1 мл бактеріофага в розведенні 10^-4, ретельно перемішуємо і залишаємо на 5 хвилин для адсорбції бактеріофага на бактеріальній клітині. Потім 0,5 мл розплавленого напіврідкого агару (0,7%) додали до суміші двох культур, перемішують і виливають другим шаромучашку Петрі з 1,5% агаром. Як тільки агар застиг, чашку ставлятьутермостат при температурі 37ºС на 7–8 годин.

Далі потрібно підрахувати кількість негативних колоній, кожна з яких виникла в результаті розмноження однієї фагової частинки. Для визначення титру бактеріофага за Граціа потрібно отриману кількість негативних колоній помножити на розведення. Наприклад, якщо фаг (в об'ємі 1 мл) з розведенням 10^-4дав на чашці 7 негативних колоній, то титр фага = 7х10^-4фагових часток в 1 мл нерозведеного субстрату.

Результат досліду занесіть до протоколу, зробіть висновок.

3. Фаготипування бактерій.Дозволяє визначити досліджуванукультуру. Воно має епідеміологічне значення, дозволяючи встановити джерело і шляхи поширення інфекції.

3.1 Фаготипування за Фішером. Принцип постановки цього досліду полягає у такому. Дно чашки Петрі з МПА розкреслюютьна квадрати і підписують тип фага, який буде нанесено. Проводять посів досліджуваної культури бактерій газоном. Через 5-10 хвилин після посіву на підсушену поверхнюпоживногосередовища у певні квадрати наносятьзавісь стандартних бактеріофагів по 1 краплі.

Після інкубації при температурі 37 ºСупродовж18–24 годин з’являються зони відсутності росту бактерій (лізису) у випадкузбігубактеріальної культури та внесеного бактеріофага. За типом фага, що спричинює лізис культури, визначають її фаготип. Результат досліду занесіть до протоколу, зробіть висновок.

Рисунок 54 – Фаготипування за Фішером

3.2. Фаготипування за Фюртом.1 мл бактеріофага вносять в 20 мл розплавленого та охолодженого до 45 ºС МПА. Суміш стерильно виливаютьв чашку Петрі і залишаютьдля застигання.Дно чашкиділять склографом на чотири сектори і підписують культуру мікроорганізмів, яка буде посіяна. У кожний сектор засіяли одну з чотирьох досліджуваних бульйонних культур бактерій. Чашку поставили в термостат при 37 ºС на 18–24 години.

Після 24 годин інкубації враховуютьрезультат. Відсутність росту бактерій в якомусь із секторів свідчить про специфічність даного цього стандартного бактеріофага відноснодослідної культури і про належність культури доцього фаготипу.

1

2

Результат досліду занесіть до протоколу, зробіть висновок.

3

4

Рисунок 55 – Фаготипування за Фюртом

3.4. Метод Отто.Визначення активності фага. У чашку Петрі налили 1,5% МПА. Після застигання чашку засіяли густим газоном 16–18-годинної бульйонної культури, гомологічної вихідному фагу, і через 16–18 хвилин посіву на висушену поверхню поживного середовища наносили краплями дослідний фільтрат (фаг). На одній чашці можна поставити декілька проб. Для цього чашку поділили на сектори і в кожний сектор вносили по одній краплі фільтрату. Після того як фаг дифундує в середовище, чашки перевернули догори дном, підписали, поставили в термостат при температурі 37 ºС на 18–24 години.

1

2

3

Позитивний результат досліду проводять за:

Рисунок 56 – Фаготипування за Отто

а) повної відсутності росту культури в місці нанесення краплі фільтрату (активний бактеріофаг);

б) наявності дрібних стерильних плям-колоній бактеріофага (бактеріофаг слабкої активності).

Результат досліду занесіть до протоколу, зробіть висновок.