5 . Дослід із виявлення множинної стійкості мікроорганізмів до антибіотиків
Техніку
постановкидивись у
занятті 4, демонстрація №10. Резистентність
до антибіотиків, яка зумовлена наявністюR-плазмід
(фактора резистентності) таRTF(Resistance transfer
factor) – трансмісивногоепісомногофактора,
що переноситьr-фактори.RTFпередається від
одних бактерій до інших
при кон'югації. Ці фактори поширені
серед кишкової родиниентеробактерій, коків та
являютьсобою молекулу ДНК, що має
кільцеву будову.
Рисунок 57 – Множинна стійкість до антибіотиків
Біохімічні механізми, які зумовлюють множинну лікарську резистентність, зв’язують із зменшенням проникності клітинної стінки, цитоплазматичної мембрани для лікарських речовин.
На демонстраційній чашці видно, що навколо дисків із антибіотиками відсутня зона затримки росту бактерій. Це свідчить про те, що бактерії мають множинну стійкість до антибіотиків. Результат досліду занесіть до протоколу, зробіть висновок.
Набута резистентність, що розвивається в результаті мутації у власній ДНК або впровадження сторонньої ДНК, у процесі трансформації, трансдукції або кон'югації може бути пов'язана як із хромосомною ДНК, так і позахромосомною (плазмідною). Бактерії володіють широким набором інструментів для боротьби з антимікробними препаратами. Точкова мутація може привести до резистентності, не порушуючи патогенності або життєздатності бактеріального штаму. Розвиток резистентності до стрептоміцину є класичним прикладом такого типу змін. Мутаційні процеси можуть також порушувати існуючі механізми резистентності, роблячи їх більш активними або надаючи їм більш широкого спектру активності. Прикладом цього є бета-лактамази розширеного спектра
Дослід трансдукції. Відомо, що передача генетичного матеріалу від одних бактерій до інших може відбуватися за допомогою фагів.
Для дослідження трансдукції використали:
помірний коліфаг, отриманий при опроміненні ультрафіолетовими променями культури донора лактозопозитивної культури E. coli lac+;
культуру реципієнта E. coli lac-(лактозонегативна);
середовище Ендо як селективне середовище з лактозою для виявлення лактозопозитивних рекомбінантів E. coli.
Методика досліду
До 1 мл бульйонної культури реципієнта (E. coli lac-) додають 1 мл фага. Пробірку ставилять на 40 хвилинутермостат. Потім зробили посів петлею на чашку Петрі з середовищем Ендо. Для контролю зробили посівіз пробірки з культурою реципієнта.
Результати досліду, що очікуються: при завершеній специфічній трансдукції разом із помірним фагом у клітину реципієнта проникає і фрагмент хромосоми донорської культури з геном, що кодує синтез лактози. При перетворенні помірного фага в профаг разоміз нимухромосому реципієнта інтегрує і цей ген. Як бачимо з демонстрації, на середовищі Ендо порядіз материнськими безбарвними лактозонегативними колоніями виросли і ре-комбінанти у вигляді колоній червоного кольору – лактопозитивні.
помірний коліфаг, отриманий при опроміненні ультрафіолетовими про-менями культури донора лактозо-позитивної культури E. coli lac+
Культура реципієнт - E. coli lac-
Інкубація у термостаті 37 ○С – 40 хвилин
Контроль
Лактозопозитивні колонії культури рекомбінанта
Дослід
Рисунок 58 – Схема постановки досліду трансдукції
Результат досліду занесіть до протоколу, зробіть висновок.
Дослід кон'югації. Кон'югація – перенесення генетичного матеріалу з клітини донора у клітину реципієнта через кон’югативний місточок.
Для досліду кон’югаціївзяли:
культуру донор E. coli F+, Her, Pro+, Ura+, His+, Strs. Ця культура має фактор фертильності, що інтегрованийухромосому, і є прототрофною (здатна до синтезу проліну, урацилу, гістидину, але чутлива до стрептоміцину);
культуру реципієнт E. coli F-, Pro-, Ura-, His-, Strr. Ця культура ауксотрофна відносно проліну, урацилу, гістидину, але резистентна до стрептоміцину;
селективне середовище для виявлення рекомбінантів: синтетичне мінімальне середовище без амінокислот та із стрептоміцином уконцентрації, що затримує ріст культури донор.
Методика проведення досліду.
До 2 мл культури реципієнта додали 1 мл культури донора. Посіви поставили у термостат при температурі 37 ºС на 10 хвилин. Після інкубації зробили посів з дослідної пробірки на селективне середовище і на це саме середовище на сектори посіяли для контролю культури донора та реципієнта. При кон’югації з клітини донора в клітину реципієнта через протоплазматичний місточок переходить фрагмент хромосоми донора з генами, що контролюють синтез проліну, гістидину, урацилу. Утворюються рекомбінанти батьківських культур, що здатні до росту на мінімальному середовищі зі стрептоміцином