Пояснення до самостійної роботи з теми «облігатні Анаероби. Виділення чистої культури облігатних анаеробних бактерій»

Анаеробні мікроорганізми	Організми, які отримують енергію за відсутності доступу кисню шляхом субстратного фосфорилювання, кінцеві продукти неповного окиснення субстрату при цьому можуть бути окиснені з отриманням більшої кількості енергії у вигляді АТФзанаявності кінцевого акцептора протонів організмами, які здійснюють окиснювальне фосфорилювання
Анаеробне дихання	Термін «анаероби» ввів Луї Пастер, який відкрив у 1861 році бактерії маслянокислого бродіння. Анаеробне дихання – сукупність біохімічних реакцій, що відбуваютьсяв клітинах живих організмів при використанні як кінцевого акцептора протонів не кисень, а інші речовини (наприклад, нітрати) і належитьдо процесів енергетичного обміну (катаболізм, дисиміляція), які характеризуються окисненням вуглеводів, ліпідів і амінокислот до низькомолекулярних сполук
Класифікація анаеробів	Згідно з усталеною в мікробіології класифікацією розрізняють: факультативні анаероби; мікроаерофіли; аеротолерантні анаероби; помірно-строгі анаероби; облігатні анаероби.
Приклади бактерій, які належатьдо облігатних анаеробів	Clostridium perfringens C.tetani, C.histolyticum, C.novyi, C.septicum, C.botulinum, Bacteroides fragilis, B.gracilisта ін.
Особливість енергетичного обміну облігатних анаеробів	Відбувається без участі вільного кисню. Гліколіз відбувається за рахунок фосфорилювання субстрату
Класифікація гліколізу за типами бродіння	Молочнокисле бродіння – рід Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium. Спиртове бродіння – сахароміцети, Candida spp. Мурашинокисле – родина ентеробактерій. Маслянокисле – деякі види клостридій. Пропіоновокисле – пропіонобактерії (наприклад, Propionibacterium acnes). Бродіння з виділенням молекулярного водню – деякі види клостридій. Метанове бродіння – наприклад, Methanobacterium. У результаті розщеплення глюкози витрачаються 2 молекули, а синтезуються 4 молекули АТФ. Таким чином, загальний вихід АТФ становить 2 молекули АТФ і 2 молекули НАД Н2. Отриманий у ході реакції піруват утилізується клітиною по-різному залежно від того, який тип бродіння вона використовує
Чому молекулярний кисень має токсичну дію на облігатні анаероби?	1. Пригнічує анаеробні енергоутворювальнихреакцій. 2. Через відсутність ферменту каталаза накопичується Н2О2 (має бактерицидну дію). 3 Через відсутність системи регуляції окисно-відновлювального потенціалу
Особливості взяття матеріалу при підозрі на анаеробну інфекцію	Етіологічну роль облігатних анаеробів припускають занаявності таких ознак: 1) неприємний запах виділень внаслідок продукції анаеробами летючих жирних кислот (описують як фекальний, для клостридій характерний запах згірклого масла); 2) гнильний характер ураження (мертві тканини у вигляді безструктурного детриту сірого або сіро-зеленого кольору); 3) ексудат сіро-зелений або чорний, містить маленькі крапельки жиру; 4) наявність газу в тканинах (синдром крепітації); 5) розвиток інфекції на тлі лікування аміноглікозидами; 6) близькість вогнища до місць природного існування анаеробів. При підозрі на анаеробну інфекцію слід ураховувати, що неправильне взяття матеріалу призведе до спотворення результату дослідження. Матеріал краще брати до початку хіміотерапії, під час розтину або дренування вогнища. Для транспортування досліджуваного матеріалу використовують транспортні середовища, що запобігають токсичній дії кисню.
Особливості виділення спороутворюючих анаеробних бактерій (клостридій, або спорогенних)	Первинні посіви прогрівають на водяній бані за температури 80 °С впродовж 20 хвилин для знешкодження вегетативних клітин сторонньої мікрофлори, яка може бутинаявною у дослідному матеріалі
Способи створення анаеробних умов для культивування облігатних анаеробів	Механічні. Фізичні. Хімічні. Біологічні
Неспороутворюючі анаеробні бактерії (НАБ)	Є численна збірна група мікроорганізмів, які належать до різних родин та родів. Морфологічно – це грамнегативні та грампозитивні палички, коки, звивисті форми бактерій:Bacteroides spp.,Porphyromonas sp., Prevotella spp., Fusobacterium spp., Leptotrichia spp., Wolionella spp.(палички);Mobiluncus spp.(зігнуті палички);Veillonella spp., Peptococcus spp.(коки) та інші
Характеристика НАБ	Для всіх цих мікроорганізмів характерно: обов’язковий анаеробіоз, чутливість до токсичної дії кисню повітря, відсутність спор, складні поживні потреби. Серед НАБ є як патогенні: збудники сифілісу – Treponemapallidum, так і умовно-патогенні мікроорганізми, більшість якихмістяться в складі нормальної мікрофлори ротової порожнини і ШКТ людей та тварин. НАБ нормальної мікрофлори кишечника обмінюються плазмідами між собою, а також з іншими бактеріями, набуваючи при цьому детермінант (генів) резистентності до багатьох антибактеріальних препаратів
Особливості виділення та культивування анаеробів	1. Анаероби культивують на спеціальних поживних середовищах, які повинні відповідати таким вимогам: a) відповідати складним потребам анаеробів і забезпечувати їх швидкий ріст, тому для культивування анаеробів використовують високопоживні середовища, що містять пептони (1,5 – 2%), дріжджовий екстракт (0,5%), вітамін К, гемин; б) утримувати занеобхідності стимулювальні добавки: баранячі еритроцити (5%), кінську сироватку (5-10%), твін-80 (0,02%); піруват натрію (0,9%); глюкозу (0,5 %); в) мати низький окиснювально-відновний потенціал, що досягається шляхом додавання редукуючих речовин. Редукуючий агент, пов'язуючи вільний кисень середовища, знижує Eh середовища.Як нетоксичніредукуючіагенти, які забезпечують відновні умови середовища, використовують цистеїн гідрохлориду (0,025%), тіогліколят натрію (0,05%), дитіотрейтол (0,05%). У деякі середовища (Кітта-Тароцці) додають шматочки тканин паренхіматозних органів (легені, печінка); д) містити селективні добавки, що забезпечують вибіркове виділення облігатно анаеробних мікроорганізмів. Як селективнідодаткові компонентивикористовують антибіотики аміноглікозидного ряду, до яких анаероби природно стійкі. 2. Посіви облігатно анаеробних мікроорганізмів культивують в атмосфері з вмістом кисню не більше 0,1%. Безкисневі умови для культивування анаеробів створюють з використанням анаеробних камер, мікроанаеростатів, або анаеробних пакетів
Для виділення облігатно анаеробних мікроорганізмів використовують середовища	- анаеробний кров'яний агаріз гентаміцином; - анаеробний кров'яний агаріз неоміцином і налідиксовоюкислотою; - анаеробний кров'яний агаріз канаміцином і ванкоміцином; - фруктозо-циклосерин-цефокситинове середовище (дляClostridium difficile); - тіогліколеве напіврідке середовище; - середовище Кітта-Тароцці (рідке середовище зі шматочками м'яса і вазеліновим маслом на поверхні); - середовище Вільсона-Блера (залізо-сульфітний агар)
Етапи бактеріологічного методу діагностики при виділенні чистої культури облігатних анаеробних інфекцій	1-йетап. 1.1. Забір матеріалу та транспортування з використанням транспортних систем для анаеробів. 1.2. Мікроскопічне дослідження матеріалу (в матеріалі наявні поліморфні мікроорганізми, або грубі грампозитивні палички з обрубаними кінцями). 1.3. Попередня обробка матеріалу методами температурного або алкогольного шоку для виділення спороутворюючих анаеробів. 1.4. Посів матеріалу на анаеробний кров'яний агар і на елективні, диференціально-діагностичні середовища (анаеробний кров'яний агаріз гентаміцином або анаеробний кров'яний агаріз неоміцином і налідиксовоюкислотою) з метою отримання ізольованих колоній. 1.5. Посів матеріалу в рідке тіогліколеве середовище з метою визначення летючих жирних кислот. 2-йетап. 2.1. Вивчення культуральних властивостей колоній на кров'яному анаеробному агарі. 2.2. Хроматографія тіогліколевого середовища та індикація анаеробівусередовищі за наявністю летючих жирних кислот. 2.3. Мікроскопія колоній. 2.4. Вивчення флюоресценції колоній за допомогою лампи Вуда. 2.5. Посів ізольованих колоній з метою визначення їх чутливості до кисню. 3-йетап. На третьому етапі досліджують властивості культур, для яких підтверджена чутливість до кисню. 3.1. Визначення чистоти культури анаеробів умазкузаГрамом. 3.2. Остаточна ідентифікація чистої культури анаеробів на підставі біохімічних ознак і спектра летючих жирних кислот. Орієнтовна ідентифікація до роду проводиться з використанням обмеженоюкількістютестів, розгорнута ідентифікація до виду – з використанням широкого спектра тестів. 3.3. Визначення спектра чутливості до антибіотиків. 4-йетап проводиться аналогічно виділенню аеробів і факультативних анаеробів
Реакція нейтралізації (РН)	РН – лабораторний серологічний тест, який застосовують для діагностики таких анаеробних інфекцій, як правець, газа гангрена, ботулізм. Механізм реакції нейтралізації полягає у тому, що антитіла імунної сироватки нейтралізують, знешкоджують, гальмують біологічну активність токсинів мікроорганізмів. Для постановки РН токсину використовують дослідження на лабораторних тваринах
Принцип реакції нейтралізації	Принцип реакції полягає в тому, що досліджувані сироватки змішують з токсиновмісним матеріалом і витримують певний час. Потім цю суміш вводять чутливим лабораторним тваринам. Про результати цієї реакції судять за загибеллю тварин. За відсутності у тварин шкідливої дії токсинів судять про нейтралізуючу дію імунної сироватки

Алгоритм виділення чистої культури анаеробних бактерій

І етап

Дослідний матеріал для накопичення анаеробів засівають у спеціальне поживне середовище для культивування анаеробів (середовище Кітта-Тароцці, бульйон Мартена та ін.). Посіви заливають вазеліновим маслом та інкубують у термостаті

ІІ етап

Враховують зміни, які відбулися у середовищі (помутніння, газоутворення)

Бульйонну культуру набирають пастерівською піпеткою, яку занурюють через шар вазелінового масла до дна пробірки

Готують фіксовані препарати, фарбують їх за Грамом, з метою вивчення морфологічних властивостей

Пересів з середовища накопичення на спеціальні щільні поживні середовища (напр. агар Цейслера, середовище Вільсона-Блера) з метою отримання ізольованих колоній. Інкубація посівів у термостаті

Методи отримання ізольованих колоній

Метод Цейслера

Метод послідовних розведень Вейнберга

ІІІ етап

Вивчають культуральні властивості бактерій. З найбільш типових колоній готують фіксовані препарати, фарбують їх за Грамом. Залишок колонії засівають на середовище Кітта-Тароцці для накопичення чистої культури

ІV етап

Культуру, що виросла після інкубації у середовщі Кітта-Тароцці, перевіряють на чистоту та ідентифікують за морфологічними, тинкторіальними, культуральними, біохімічними, антигенними та іншими властивостями