1.8. Методы количественного определения белков

Для определения концентрации белков в биологических жидкостях и растворах используются оптические, колориметрические и азотометрические методы.

Оптические методы основаны на оптических свойствах белков. К ним относятся:

• спектрофотометрические методы, оценивающие интенсивность поглощения белками УФ лучей в диапазоне около 200 нм и 260 нм. Степень УФЛ - поглощения пропорциональна концентрации белка;

• рефрактометрические методы основаны на способности растворов белков преломлять свет пропорционально их концентрации;

• нефелометрические методы основаны на способности растворов белков рассеивать свет пропорционально их концентрации;

• поляриметрические методы основаны на способности растворов белков вращать плоскость поляризованного света пропорционально их концентрации.

Колориметрические методы основаны на цветных реакциях белков – биуретовая реакция, метод Лоури, метод сорбции белками определённых красителей. Интенсивность окраски определяется концентрацией белкового раствора.

Азотометрические методы основаны на определении содержания азота и пересчёте его на концентрацию белка (в белках 16% азота).

1.9. Выделение, фракционирование и очистка белков

Выделение белков из тканей включает несколько этапов.

1. Гомогенизация (измельчение) ткани для разрушения клеточных и внутриклеточных мембран, препятствующих выделению белков. В процессе гомогенизации нередко добавляются детергенты.

2. Экстрагирование (растворение) белков проводят чаще всего слабыми солевыми растворами.

3. Отделение низкомолекулярных веществ (солей) методом диализа с использованием полупроницаемых мембран, методом гель - фильтрации.

4. Очистка белка от сопутствующих белков (фракционирование), основанная на различных физико-химических свойствах белков.

а) ультрацентрифугирование – разделение белков по молекулярной массе;

б) электрофорез – разделение белков по заряду молекулы и молекулярной массе;

в) фракционное высаливание – подбор концентрации соли для осаждения различных белков;

г) хроматографические методы разделения:

• распределительная хроматография – по различной растворимости белков;

• гель-фильтрация – по различной молекулярной массе белков

• ионообменная хроматография – по разнице зарядов белковых молекул

• аффинная хроматография – по химическим свойствам различных белков

5. Выделение белка в кристаллическом состоянии проводится путём лиофилизации (высушивания) при низкой температуре.

1.10. Классификация белков

Огромное количество белков в организме, многообразие их свойств и биологических функций определяют сложности их систематики.

Предложены различные классификации белков по структурному, функциональному принципам.

«На сегодняшний день о белках известно слишком много, чтобы удовлетворится старой классификацией, и слишком мало для того, чтобы составить лучшую классификацию» - такое определение состояния вопроса о классификации белков остаётся актуальным до настоящего времени.

В практическом отношении достаточно удобна классификация белков, учитывающая особенности их химического состава и физико–химических свойств. Согласно этой классификации, все белки делят на 2 группы: простые (протеины) и сложные (протеиды)