1.1. Проявления, механизмы развития и регуляция апоптоза на уровне клетки

/././. Феноменология и методы выявления апоптоза

Наиболее характерные проявления апоптоза определяются тем, что первые события, связанные с его осуществлением, начинаются в ядре. В ядре регистрируются первые морфологи­ческие признаки апоптоза — конденсация хроматина с фор­мированием его осмиофильных скоплений, прилежащих к ядерной мембране. Позже появляются вдавления ядерной мембраны и происходит фрагментация ядра. Отшнуровавшие-ся фрагменты ядра, ограниченные мембраной, обнаруживают­ся вне клетки; их называют апоптотическими тельцами. В ци­топлазме происходят расширение эндоплазматического рети-кулума, конденсация и сморщивание гранул. Важнейший при­знак апоптоза — снижение трансмембранного потенциала ми­тохондрий. Клеточная мембрана утрачивает ворсинчатость и в то же время образует пузыревидные вздутия. Клетки округля­ются и отделяются от субстрата. Проницаемость мембраны

Рис. 1.1. Развитие некроза и апоптоза клеток. Характерные морфо­логические проявления.

Таблица 1.1. Сравнительная характеристика апоптоза и некроза клеток

Показатели	Апоптоз	Некроз
Пусковой фактор	Сигнал, воспринимаемый мембранными рецептора­ми, или отсутствие сигна­ла	Токсические и мем-бранотропные аген­ты, неадекватные внешние условия

повышается лишь в отношении небольших молекул, причем это происходит позже изменений в ядре: если конденсация хроматина проявляется в пределах 1 ч, то повышение прони­цаемости для пропидия йодида — только через 3—5 ч. Как уже упоминалось, одной из наиболее характерных особенностей апоптоза является уменьшение объема клетки в противопо­ложность ее набуханию при некрозе. В схематической форме морфологические проявления апоптоза и некроза отражены на рис. 1.1. Следует обратить внимание на увеличение разме­ров клетки и ранние изменения мембраны, но не ядра при не­крозе и уменьшение размеров клетки с ранними изменениями в ядре, но не в цитоплазме при апоптозе. Признаки апоптоза и некроза сопоставлены в табл. 1.1.

Продолжение табл. 1.1

Показатели

Апоптоз

Некроз

Скорость развития

Локализация пер винного поврежде ния

Причины гибели клетки

Изменения размера клетки

Изменения ядра

Изменения в цито­плазме

Изменения клеточ­ной мембраны

Состояние ДНК

Энергозависимость

Зависимость от синтеза макромоле кул

Примеры проявле ния

Методы выявления: морфологические тинкториальные

цитофлуоримет-рические

электрофоретиче-ские 1-12 ч В ядре

Деградация ДНК, нару­шение энергетики клетки

Уменьшение (сморщива­ние)

Конденсация хроматина, пикноз, фрагментация

Конденсация цитоплаз мы, уплотнение гранул

Потеря микроворсинок, образование вздутий

Разрывы с образованием сначала крупных, затем мелких фрагментов

Зависит

Метаморфоз, отрицатель­ная селекция лимфоци­тов, гормонозависимая атрофия, интерфазная ра­диационная гибель лим­фоцитов

Сморщивание клетки

Ослабление окрашивае­мое™ ДНК-тропными красителями

Гиподиплоидность, уменьшение размеров клетки, появление фос-фатидилсерина на мем­бране

Формирование дискрет­ных фракций («лесенки») при электрофорезе ДНК

В пределах 1 ч В мембране

Нарушение целости мембраны

Увеличение (набуха­ние)

Набухание

Лизис гранул

Нарушение целости

Неупорядоченная деградация

Не зависит

Гибель клеток вслед­ствие гипоксии, дей­ствия токсинов, ви­русного цитолиза, комплементзависи-мого цитолиза

Набухание клетки

Окрашиваемость

суправитальными

красителями

Окрашиваемость йодидом пропидия

Размазанное пятно при электрофорезе ДНК

2—1385

17

Указанные морфологические проявления апоптоза изуче­ны в модельных опытах in vitro. Апоптотические клетки труд­но выявить в тканях in situ в связи с тем, что они быстро фаго­цитируются не только макрофагами и нейтрофилами, но и другими окружающими клетками, не являющимися «профес­сиональными» фагоцитами. Быстрота фагоцитирования связа­на с появлением на их поверхности (вследствие реорганиза­ции мембраны) некоторых молекул, распознаваемых фагоци­тами; такими молекулами являются фосфосерин, тромбоспон-дин, десиалированные мембранные гликоконъюгаты. В ре­зультате фагоцитоза, которому клетки подвергаются уже в процессе развития апоптоза, их содержимое не выделяется в межклеточное пространство, как это бывает при некрозе, когда вокруг гибнущих клеток скапливаются их активные внутриклеточные компоненты, включая энзимы, закисляется среда, что способствует гибели других клеток и развитию очага воспаления. Апоптоз поражает индивидуальные клетки и практически не отражается на их окружении.

Главное проявление апоптоза — деградация хроматина. Ее основой служит ферментативное расщепление ДНК, которое происходит в несколько этапов с формированием все более мел­ких фрагментов. Сначала образуются фрагменты, включающие 700; 200—250; 50—70 тыс. пар нуклеотидов (т.п.н.), затем — фрагменты, содержащие 30—50 т.п.н. [Zhivotovsky В. et al., 1994J. На этой стадии происходят конденсация хроматина и инвагина­ции ядерной мембраны. После реализации этого этапа процесс становится необратимым. Затем наступает очередной этап дег­радации, который изучен наиболее полно и служит широко при­нятым опознавательным признаком апоптоза, — межнуклео-сомная дезинтеграция ДНК, т.е. разрывы нитей ДНК, находя­щихся между нуклеосомами. При этом образуются фрагменты, кратные по величине 180—200 пар нуклеотидов, что соответст­вует протяженности нити ДНК в пределах одной нуклеосомы. ЕИ-от тип деградации обычно завершается в течение суток. При всей типичности для апоптоза этого типа расщепления ДНК из­вестны примеры, когда процесс ограничивается образованием более крупных фрагментов.

Деградация хроматина при апоптозе является активным процессом, зависящим от температуры, источников энергии, синтеза РНК и белка de novo. Различные этапы деградации ДНК катализируются разными формами эндонуклеаз, отлича­ющимися субстратной специфичностью и условиями проявле­ния активности (см. далее).

Несмотря на безусловно ключевую роль деградации ДНК в осуществлении апоптоза, между этими процессами нельзя по­ставить знак равенства. Во-первых, морфологические и био­химические изменения в цитоплазме и мембранах, характер­ные для апоптоза (снижение трансмембранного потенциала

митохондрий, накопление реактивных форм кислорода и т.д.), могут быть индуцированы в энуклеированных (безъядерных) клетках, т.е. в ситуации, когда деградация хроматина невоз­можна в связи с его отсутствием. Во-вторых, непосредствен­ной причиной смерти клетки при апоптозе являются не разру­шение ДНК и прекращение работы генов, поскольку их по­следствия сказываются несколько позже того срока, когда на­ступает апоптотическая гибель клетки. Предполагают, что ее гибель обусловлена энергетическим голодом, вызванным рас­ходованием АТФ на работу по репарации поврежденной ДНК.

Методы выявления апоптоза достаточно разнообразны. Ориентировочная идентификация апоптоза возможна на ос­новании вышеназванных морфологических признаков. Более доказательные подходы к оценке апоптоза основаны на выяв­лении формирующихся разрывов ДНК, ее деградации и поте­ри клеткой части генетического материала. Часто используют электрофоретическое разделение полидезоксирибонуклеотид-ных фрагментов, экстрагируемых из клеток; на электрофоре-грамме фрагменты образуют характерную «лесенку» (серию прерывистых полос), отражающую дискретный характер меж-нуклеосомных разрывов [Zhyvotovsky В. et al., 1995]. Другие методы основаны на синтезе олигонуклеотидов из меченых предшественников, катализируемом дезоксирибонуклеоти-дилтрансферазой (TdT), и их встраивании в ДНК через ее сво­бодные концы, формирующиеся в участках разрывов. Встра­ивание меченых олигонуклеотидов затем выявляется с помо­щью цитофлуорометрических или морфологических методов. На этом, в частности, основан TUNEL (TdT-mediated dUTR-biotin nick end-labeling) — метод оценки апоптоза [Gavrieli Y. et al., 1992].

В настоящее время широко используется скрининговый цитофлуорометрический метод определения численности апо-птотических клеток, основанный на утрате ими части хрома­тина. При этом фиксированные клетки окрашивают йодидом пропидия, который, проникая в ядро, взаимодействует с ДНК, что позволяет выявить процент гиподиплоидных клеток с по­мощью проточной цитофлуорометрии [McCloskey T.W. et al., 1994]. На регистрации снижения трансмембранного потенци­ала митохондрий основан метод определения апоптоза по изменению окрашивания липофильными катионными флуо-рохромами, например йодидом дигексилоксикарбоцианина или родамином, тройными к внутренней поверхности мембра­ны митохондрий. Наконец, широкое распространение полу­чил метод раннего цитофлуорометрического обнаружения апоптоза по связыванию меченого аннексина V с фосфатидил-серином, который, как уже отмечалось, появляется на поверх­ности клеток, подвергающихся апоптозу. Параллельно клетки (нефиксированные) окрашивают йодидом пропидия, который

способен проникать лишь в клетки, подвергающиеся некрозу. Окрашивание одним аннексином служит показателем раннего апоптоза, окрашивание йодидом пропидия — свидетельством некроза, окрашивание обоими красителями — показателем позднего апоптоза, к которому присоединился вторичный не­кроз [Van Engeland М. et al., 1998].