1.1.4. Общий путь индукции апоптоза

Известно два относительно автономных проявления обще­го пути индукции апоптоза — активация сериновых протеаз и снижение трансмембранного потенциала митохондрий.

Анализ генетического контроля апоптоза у нематоды Caenorhabditis elegans показал, что реализация апоптоза детер­минируется двумя генами — ced-З и ced-4. Эффекты продукта ced-4 неизвестны, но продукт ced-З идентифицирован как цис-теиновая протеаза, и его гомологи обнаружены у млекопитаю­щих. Они образуют семейство ферментов, называемых каспа-зами [Alnemri E.S., 1996; Thornberry N.A., Lazebnik Y., 1998]. Именно они являются основными факторами, ответственны­ми за реализацию апоптоза. Выше было показано, что «част­ные» этапы развития апоптоза завершаются активацией фер­ментов каспаз. Каспазы представляют собой подсемейство цистеиновых протеиназ, специфичных по отношению к участ­кам полипептидных молекул, содержащих остатки аспараги-новой кислоты.

В покоящейся клетке присутствуют неактивные молеку­лы — предшественники каспаз, которые представляют собой гетеродимеры, состоящие из цепей с мол. массой около 20 и 10 кДа и содержащие ингибиторный домен. При активации этот домен отщепляется, а гетеродимеры объединяются по два, формируя тетрамер. Каспазы разделяют на две группы — инициаторные каспазы (каспазы 8, 9; вероятно, также 2 и 10) и эффекторные каспазы (каспазы 3, 6, 7); функция других каспаз и их роль в развитии апоптоза пока точно не установлены. Разделение каспаз на указанные группы отражает каскадный характер их функционирования.

Индукторы апоптоза приводят к активации инициаторных каспаз. Так, активирование каспазы 8 происходит при включе­нии рецепторного механизма запуска апоптоза с участием мо­лекулы FADD, а каспазы 9 — при действии цитотоксических агентов с участием множества факторов — APAF-1, цитохро-ма-с, дезоксиаденозинфосфата и др. Функция инициаторных каспаз состоит в активации эффекторных каспаз, которые

имеют около 40 различных молекул-мишеней в ядре, мито­хондриях и цитоплазме. К числу ядерных мишеней каспаз от­носятся ферменты, связанные с репарацией ДНК, в частности PARP (poly-ADP-ribosylpolymerase), белок Rb, принимающий участие в контроле клеточного цикла, ДНК-зависимые проте­инкиназы, которые участвуют в перестройке и репарации ДНК, белок I^CAD/DFF45, совмещающий функции активатора и ингибитора ДНКазы CAD, а также топоизомераза I, ламин, фодрин, малый ядерный рибонуклеопротеин U1 и т.д.

Основным механизмом, с помощью которого каспазы участ­вуют в реализации апоптоза, является инактивация бел­ков — ингибиторов ДНКаз.

Так, расщепление ингибиторного белка 1°*° приводит к ак­тивации ДНКазы CAD (caspase-activated desoxyribonuclease), ко­торая ответственна за межнуклеосомную фрагментацию ДНК. Действуя на ядерные молекулы, каспазы подавляют процессы репарации, репликации и реорганизации ДНК, что делает не­возможным нормальное функционирование генов. Кроме того, каспазы реализуют свои эффекты путем ослабления отрицатель­ной регуляции апоптоза, например, вследствие расщепления фактора Вс1-2. Еще один механизм их действия обусловлен пря­мым разрушением клеточных структур, например ядерной плас­тины, образованной белками — ламинами, или структур цито-скелета, содержащих мишени каспаз — гельсолин, киназы FAK, РАК2 и т.д. Это приводит к характерным изменениям формы клеток, нарушению их подвижности, ослаблению адгезии и вза­имосвязей с окружающими клетками.

Хотя в настоящее время ясно, что механизмы апоптоза не сводятся исключительно к деградации ДНК, этому процессу и осуществляющим его ферментам отводится очень важная роль в апоптотической гибели клеток. Деградация ДНК при апо-птозе реализуется в 3 этапа, которым соответствуют форми­рование однонитевых разрывов, образование крупных (50— 200 т.п.н.) фрагментов и формирование мелких (180—200 пар нуклеотидов) фрагментов ДНК вследствие двунитевых меж-нуклеосомных разрывов [Zhivotovsky В. et al., 1994]. За форми­рование этих разрывов ответственны ферменты эндонуклеазы. Несмотря на пристальное внимание к данной проблеме, успе­хи в изучении эндонуклеаз, участвующих в реализации апо­птоза, до сих пор невелики.

Эндонуклеазы, обусловливающие реализацию межнуклео-сомной деградации хроматина, должны отвечать ряду крите­риев:,локализоваться в ядре апоптотических клеток, обладать специфичностью к межнуклеосомному участку ДНК, способ­ностью катализировать одно- и двунитевые разрывы, отщеп­лять фрагменты как с 5'-, так и с З'-концов, активироваться активаторами апоптоза и подавляться его ингибиторами. В той

или иной степени этим критериям соответствует ряд фер­ментов: резидентная Са²⁺-, Мв²⁺-зависимая эндонуклеаза (18 кДа), в неактивной форме входящая в состав высокомоле­кулярного комплекса (100 кДа) и освобождающаяся из него в активной форме под влиянием индукторов апоптоза; упоми­навшаяся выше ядерная каспазозависимая ДНКаза (CAD); Са²⁺-, Мв²⁺-зависимая эндонуклеаза, присутствующая в ядре в формах с мол. массой 45, 47 и 49 кДа; цитоплазматические ДНКазы 1 и II; ядерная I-подобная ДНКаза. Тем не менее во­прос о реальном вкладе этих эндонуклеаз в осуществление апоптоза окончательно не решен.

Общепризнанной является роль в развитии апоптоза изме­нений, затрагивающих митохондрии. К ним относятся про­цессы, которые сопровождаются потерей митохондриями мембранного потенциала с утратой положительного заряда внутренней поверхности мембраны, повышением проницае­мости мембраны и ее дезинтеграцией, нарушением цепей транспорта электронов, снижением содержания восстанов­ленного глутатиона, NAD(P)H₂, усиленным образованием супероксиданиона, выходом Са²⁺ и митохондриальных белков (в том числе причастных к запуску апоптоза) в цитоплазму [Kroemer G. et al., 1997; Waterhouse N.G., Green D.R., 1999]. Среди белков, поступающих из митохондрий в цитоплазму, особенно важен цитохром-с, активирующий каспазу 9. С ми­тохондриями связаны продукты протоонкогенов семейства bcl-2, баланс которых изменяется в пользу факторов, стимули­рующих апоптоз. Нарушения метаболических процессов в ми­тохондриях приводят к энергетическому голоду клетки — одной из главных непосредственных причин апоптотической гибели клеток. Таким образом, в процессе апоптоза происхо­дит формирование энергетического дефицита за счет значи­тельных затрат энергии на реализацию метаболических реак­ций, сопровождающих апоптоз, а также на постоянно идущие процессы репарации поврежденных структур.

Таким образом, к гибели клетки приводят различные нару­шения, проявляющиеся при развитии апоптоза. Среди них основными являются процессы, приводящие к деградации жизненно важных молекул и структур клетки, а также ис­черпание ее энергетических ресурсов.