21.2.5. Измерение аналитического сигнала

Для измерения интенсивности флуоресценции используют спек- трофлуориметры и флуориметры (на рис. 21.5).

В качестве источника излучения используют ртутную, ксеноно- вую и другие лампы. В последнее время для возбуждения флуорес­ценции применяют лазеры.

Для выделения нужного спектрального интервала в флуоримет- рах, как и в фотоэлектроколориметрах, используют светофильтры, а в спектрофлуориметрах, также как и в спектрофотометрах - монохрома- торы (дифракционные решётки или призмы). Светофильтр (монохро- матор), используемый для выделения необходимого возбуждающего излучения, называется первичным,а для выделения наиболее интен­сивного излучения из спектра испускания - вторичным.

Рис. 21.5.Принципиальная схема прибора для измерения интенсивности флуоресценции

Измерение флуоресценции, в отличие от измерения поглощения, чаще всего проводят под прямым углом к направлению возбуж­дающего света.Такой приём позволяет избежать наложения возбуж­дающего света на излучаемый. При измерении интенсивности фосфо­ресценции, либо при большом Стоксовом сдвиге, можно использо­вать схему, при которой источник возбуждения, образец и детектор находятся на одной оптической оси. В данном случае возбуждающий свет не мешает определению, так как при измерении интенсивности фосфоресценции измерение проводят после прекращения действия возбуждающего света, а при большом Стоксовом сдвиге ^_возб и ^_исп настолько различаются, что возбуждающий свет задерживается моно- хроматором и не попадает на детектор. В случае сильно поглощаю­щих растворов, полупрозрачных и твёрдых образцов используют фронтальный способ, при котором измерение флуоресценции прово­дится под углом 45° относительно возбуждающего излучения.

При измерении флуоресценции имеют дело со слабым излуче­нием, поэтому в качестве детектора используют не фотоэлементы, как в спектрофотометрии, а фотоумножители.

21.2.6. Практическое применение и основные приёмы люми­несцентного анализа

К люминесцентной спектроскопии относят:

• флуоресцентный метод анализа (флуориметрия),

• фосфоресцентный метод анализа (фосфориметрия),

• хеми- и биолюминесцентный метод анализа (люминометрия)и

др.

Наиболее широкое применение среди перечисленных люминес­центных методов анализа имеет флуориметрия. По сравнению со спектрофотометрией флуориметрия обладает:

• большей избирательностью(не все вещества, поглощающие УФ- и видимое излучение, способны флуоресцировать);

• более низким пределом обнаружения(измерить абсолютную величину малого сигнала всегда легче, чем разность между двумя большими сигналами);

• удобным временным диапазоном.

Поглощение света - это практически мгновенный процесс (10^-15- 10^-16с), флуоресценция длится около 10 нс (а фосфоресценция значи­тельно дольше). За это время с молекулой могут произойти различные процессы, которые влияют на характеристики флуоресценции. Данное свойство широко используется в биохимии для изучения строения мембран, диффузии биомолекул, динамики связывания антигенов и антител. Влияние вращения молекул антигенов (лекарств, ядов), ме­ченых флуоресцеином, на поляризацию флуоресценции последнего лежит в основе поляризационного флуороиммуноанализа,одного из современных методов анализа биологических объектов.

Флуоресцентный анализ используют для обнаружения и для ко­личественного определения веществ. В качественном анализе чаще всего используется способность вещества флуоресцировать тем или иным цветом. При этом в качестве источника возбуждения обычно используют УФ-лампу, а наличие или отсутствие флуоресценции оп­ределяют визуально. Таким образом, например, обнаруживают флуо­ресцирующие вещества на плоскостных хроматограммах.

В количественном анализе используют зависимость интенсивно­сти флуоресценции от концентрации флуоресцирующего вещества либо, реже, зависимость уменьшения интенсивности флуоресценции от концентрации тушителя, в роли которого выступает вещество, кон­центрацию которого необходимо определить.

В флуоресцентном анализе используется:

• измерение собственной флуоресценции вещества;

• получение флуоресцирующих продуктов, в том числе иэкс­тракционная флуориметрия;

• определения, основанные на тушении флуоресценции;

• титрование с флуоресцентными индикаторами и др.

Флуориметрическое определение, основанное на собственной флуоресценции, используется для определения хинина, берберина, рибофлавина, фторхинолонов, флуоресцеина и т.д.