39.Використання клітинних культур в вірусології та їх класифікація. Середовища для їх культивування.

Класифікація клітинних культур Враховують такі ознаки: кількість пасажей (перенос клітин у нове середовище) і походження клітин.

Типи клітинних культур:

1. Первинно трипсинізовані - одержують з швидкозростаючих ембріональних тканин (людини, мавпи), кіл-сть пасажей 8-10;

2. Пасажні або перещеплювані – одержують з пухлинних тканин, кіл-сть пасажей не обмежено. Клітини злоякісні. Не можливо вивчати взаємодію з вірусом. Але для виділення вірусів ці кліт зручні.

3. Напівперещеплювані або диплоїдні клітинні штами - одержують з норм кліток, набір хромосом диплоїдний,, кіл-сть пасажів до 100.Використ для одержання вірусних вакцин. Це клітини шкіри, легенів.

- Живильні середовища для культур кліток містять повний набір амінокислот, вітамінів, ростові фактори: гідролізат лактальбуміна, сухі середовища і концентрати, які перед використанням розводять. Для вирощування клітинних культур використовують ростові середовища, збагачені сироватками тварин і людини . (бичача сироватка, ембріональна коров'яча сироватка)

40.Антитіла (імуноглобуліни), їх будова. Класи імуноглобулінів, їх функції.

Антитіла – це імуноглобуліни, які специфічно реагують з антигеном, що стимулює їх утворення. За хімічною природою вони є глікопротеїдами, тому що складаються з протеїну та олігосахариду, який містить гексозу, аміносахар та сіалову (нейрамінову) кислоту.

Імуноглобуліни виконують різноманітні біологічні функції. До первинних функцій антитіл відносять їх взаємодію з комплементарною структурою антигенів, до вторинних – фіксацію комплемента, участь у реакціях опсонізації, у прояві цитотоксичної дії, імунорегулярторний вплив на клітини імунної системи та виділення ними біологічно активних речовин тощо.

Молекула імуноглобуліну складається з двох фрагментів: Fab (F antigen binding) – будуючого (взаємодіє з антигеном) та Fc- кристалічного (взаємодіє з компонентами комплементу та відповідними рецепторами). Кожний з цих фрагментів складаються з двох ідентичних важких ланцюгів (Н - heavy) та двох ідентичних легких ланцюгів (L - light). Легкі ланцюги можуть бути двох типів: лямбда ( λ ) та каппа (κ), а важкі –5 типів: альфа (α), мю (μ), гама (γ), дельта (δ), епсилон (ε). Важкі ланцюги визначають клас імуноглобулінів (IgА, IgМ, IgG, IgЕ, IgD). Легкі і важкі ланцюги зв’язані між собою дисульфідними (ковалентними) і нековалентними зв’язками. Кожна молекула імуноглобуліну має варіабельну зону, яка змінюється відповідно до структури антигену та константну зону, яка стабільна протягом життя і характерна для кожної особи. Відповідно до кількості та структури важких ланцюгів імуноглобуліни поділяються на підкласи: IgG – IgG1, IgG2, IgG3, IgG4; IgM – IgM1, IgM2; IgA – IgA1, IgA2. Найбільш специфічні антитіла – це антитіла класу IgG, найменш специфічні – IgM.

Ig М – вміст у сироватці крові коливається в межах 0,4-2,2 г/л, що дорівнює 10% від загального об’єму всіх імуноглобулінів; фетальний IgM починає утворюватися на 22-й день гестації; період напіврозпаду 4-5 днів; час дозрівання – до 1-го року життя дитини; пентамер; мало специфічний; утворює великі імунні комплекси; володіє високою аглютинуючою і комплементарною активністю; приймає участь у формуванні первинної імунної відповіді (при першому контакті антигену з В-лімфоцитами); не проникає через судинну стінку та плаценту; активує систему комплементу за класичним шляхом. Ig М входить до складу бактеріолізинів, цитолізинів, резус-фактору, ревматоїдного фактору, ізогемаглютинінів, антитіл проти грамнегативних бактерій, шигел тощо.

Ig G – вміст у сироватці крові коливається в межах 5-18 г/л, що дорівнює 75% від загального об’єму всіх імуноглобулінів; період напіврозпаду 21-28 днів; час дозрівання – до 4-5-го року життя дитини; мономер з різними конформаціями важких ланцюгів; проникає через плаценту та судинну стінку в тканини; функціонує у вигляді 4 ізотипів (IgG1- 60% - 5,0-12,0 г/л; IgG2 – 30% - 2,0-6,0 г/л; IgG3 - 7% - 0,5-4,0 г/л; IgG4 – 3% - 0,1-1,0 г/л); IgG1 і IgG4 – опсоніни, IgG2 – антитіла до ліпополісахаридів, IgG4 – антитіла до факторів зсідання крові, блокують рецептори для IgE на тучних клітинах); 35% IgG знаходиться в крові, 65% - в тканинах; високо специфічний; приймає участь у формуванні вторинної імунної відповіді (при повторному контакті антигену з В-лімфоцитом); активує систему комплементу за класичним шляхом; викликає активну аглютинацію та преципітацію білків; забезпечує пасивний специфічний імунітет дитини протягом перших 8-ми місяців життя; ізотопи IgG1 та IgG3 приймають участь у антитілозалежній цитотоксичності та в процесах нейтралізації різних токсинів; активує фагоцитоз як опсонін (IgG1 та IgG3); входить до складу імунних комплексів. До класу IgG відносяться: антитіла проти вірусів, нейротоксинів, правця, грампозитивних бактерій, малярійного плазмодія, автоантитіла тощо.

Ig А – вміст у сироватці крові коливається в межах 0,5-3 г/л, що дорівнює 15% від загального об’єму всіх імуноглобулінів; період напіврозпаду 5-6 днів; час дозрівання – до 10-13 років життя дитини; сироватковий IgА - мономер; функціонує у вигляді 2 ізотипів (IgА1 – 0,5-3,0 г/л; IgA2 – до 0,5 г/л); активує систему комплементу за альтернативним шляхом, руйнує мікроорганізми і токсини; формує секреторний sIgА, який функціонально більш активний. Секреторний sIgА – це димер; він приєднує секреторний компонент «s», який синтезується епітеліальними клітинами слизових оболонок і захищає білкову молекулу імуноглобуліну від впливу протеолітичних ферментів; основний фактор місцевого гуморального набутого імунітету слизових оболонок; не проникає через плаценту. Найбільша концентрація sIgА виявлена в сльозах, слині, грудному молоці, молозиві, інших секретах. Основні функції sIgА: формування протиінфекційного імунітету; попереджує розвиток автоімунних і алергічних хвороб; посилює неспецифічні гуморальні антибактеріальні фактори захисту; володіє протизапальною активністю (не активізує систему комплементу, знижує здатність IgG активізувати компоненти комплементу та активність опсонінів щодо фагоцитозу).

IgЕ – концентрація в крові становить 0,001-0,004 г/л; період напіврозпаду 2-3 дні; час дозрівання – до 15 років життя дитини; мономер. Це антитіла вогнища альтерації, які активують макрофаги, тучні клітини та еозинофіли, посилюють фагоцитоз та активність нейтрофілів; забезпечують антигельмінтний та антипаразитарний захист; не активують систему комплементу, не проникають через плаценту; міцно зв’язуються з відповідними рецепторами на базофілах/тучних клітинах, викликаючи їх дегрануляцію з виділенням біологічно активних речовин алергії (гістамін, гепарин, серотонін тощо). ІgЕ разом з sIgА формують місцевий захист слизових оболонок.

IgD – концентрація в крові становить 0-0,5 г/л; період напіврозпаду 3 дні; мономер; функція повністю не досліджена, володіє антивірусною активністю, впливає на диференціацію В-лімфоцитів, рівень його зростає при вагітності та при онкопатології; виявляється в тканині мигдаликів та аденоїдів; не активує систему комплементу; є маркером зрілих В-лімфоцитів. Деякі дослідники стверджують, що IgD приймає участь у формуванні місцевого захисту та формуванні автоімунних процесів.

Імуноглобуліни виконують в організмі функцію антитіл, синтезуються плазматичними клітинами, які є кінцевим етапом диференціювання В-лімфоцитів внаслідок антигенного стимулу та хелперного сигналу. Імуноглобуліни відносяться до поліфункціональних білків та реалізують наступні основні функції:

• специфічно розпізнають різноманітні антигени та гаптени;

• взаємодіють з іншими імунокомпетентними клітинами, які мають до них відповідні рецептори;

• активують систему комплементу, фагоцитоз, натуральні кілерні клітини тощо.

Природа імуноглобулінів. У відповідь на введення антигену імунна система виробляє антитіла - білки, здатні специфічно з'єднуватися з антигеном, що викликав їх освіту, і таким чином брати участь в імунологічних реакціях. Відносяться антитіла до γ-глобулінів, т. Е. Найменш рухомий в електричному полі фракції білків сироватки крові. В організмі γ-глобуліни виробляються особливими клітинами - плазмоцитами. γ-глобуліни, що несуть функції антитіл, отримали назву імуноглобулінів і позначаються символом Ig. Отже, антитіла - це імуноглобуліни, що виробляються у відповідь на введення анті¬гена і здатні специфічно взаємодіяти з цим же антигеном.

Функції. Первинна функція полягає у взаімодсйствіі їх активних центрів з комплементарними їм детермінантами антигенів. Вторинна функція полягає в їх здатності:

• пов'язувати антиген з метою його нейтралізації і елімінації з організму, т. Е. Брати участь у формуванні захисту від антигену;

• брати участь в розпізнаванні «чужого» антигену;

• забезпечувати кооперацію імунокомпетентних клітин (макрофагів, Т- і В-лімфоцитів);

• брати участь в різних формах імунної відповіді (фагоцитоз, кілерні функція, ГНТ, ГЗТ, імунологічна толерантність, імунологічна пам'ять).

Структура антитіл. Білки імуноглобулінів за хімічним складом відносяться до гликопротеидам, так як складаються з протеїну і Сахаров; побудовані з 18 амінокислот. Мають видові відмінності, пов'язані головним чином з набором амінокислот. Їх молекули мають циліндричну форму, їх видно в електронному мікроскопі. До 80% імуноглобулінів мають константу седиментації 7S; стійкі до слабких кислот, лугів, нагрівання до 60 ° С. Виділити імуноглобуліни з сироватки крові можна фізичними і хімічними методами (електрофорез, Ізоелектрична осадження спиртом і кислотами, висолювання, аффинная хроматографія та ін.). Ці методи використовують у виробництві при приготуванні імуно-біологічних препаратів.

Імуноглобуліни за структурою, антигенними та імунобіологічних властивостей поділяються на п'ять класів: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD. Імуноглобуліни М, G, А мають підкласи. Наприклад, IgG має чотири підкласу (IgG ,, IgG2, IgG3, IgG4). Всі класи і підкласи різняться за амінокислотною послідовністю.

Молекули імуноглобулінів всіх п'яти класів складаються з поліпептидних ланцюгів: двох однакових важких ланцюгів Н і двох однакових легких ланцюгів - L, з'єднаних між собою дисульфідними містками. Відповідно кожному класу імуноглобулінів, тобто М, G, A, E, D, розрізняють п'ять типів важких ланцюгів: μ (мю), γ (гамма), α (альфа), ε (епсилон) і Δ (дельта), що розрізняються по антигенности. Легкі ланцюги всіх п'яти класів є загальними і бувають двох типів: κ (каппа) і λ (лямбда); L-ланцюги імуноглобулінів різних класів можуть вступати в з'єднання (рекомбінуватися) як з гомологічними, так і з гетерологічними Н-ланцюгами. Однак в одній і тій же молекулі можуть бути тільки ідентичні L-ланцюга (κ або λ). Як в Н, так і в L-ланцюгах є вариабельная - V область, в якій послідовність амінокислот непостійна, і константная - С область з постійним набором амінокислот. У легких і важких ланцюгах розрізняють NH2- і СООН-кінцеві групи.

При обробці γ-глобуліну меркаптоетанолом руйнуються дисульфідні зв'язки і молекула імуноглобуліну розпадається на окремі ланцюги поліпептидів. При впливі протеолітичних ферментів папаїном імуноглобулін розщеплюється на три фрагменти: зо два не кристалізуються, містять детермінантні групи до антигену і названих Fab-фрагментами I і II і один кристалізується Fc-фрагмент. FabI- і FabII-фрагменти подібні за властивостями і амінокислотним складом і відрізняються від Fc-фрагмента; Fab-і Fc-фрагменти є компактними утвореннями, з'єднаними між собою гнучкими ділянками Н-ланцюги, завдяки чому молекули імуноглобуліну мають гнучку структуру.

Як Н-ланцюги, так і L-ланцюга мають окремі, лінійно пов'язані компактні ділянки, названі доменами; в Н-ланцюги їх по 4, а в L-ланцюга - по 2.

Активні центри, або детермінанти, які формуються в V-областях, займають приблизно 2% поверхні молекули імуноглобуліну. У кожній молекулі є дві детермінанти, пов'язані з гіперваріабельні ділянкам Н-і L-ланцюгів, т. Е. Кожна молекула імуноглобуліну може зв'язати дві молекули антигену. Тому антитіла є двовалентними.

Типовий структурою молекули імуноглобуліну є IgG. Решта класи імуноглобулінів відрізняються від IgG додатковими елементами організації їх молекули.

У відповідь на введення будь-якого антигену можуть вироблятися антитіла всіх п'яти класів. Зазвичай спочатку виробляється IgM, потім IgG, інші - дещо пізніше.

Імуноглобуліни за структурою, антигенними та імунобіологічних властивостей поділяються на п'ять класів: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.

Імуноглобулін класу G. ізотипів G випадках становить основну масу Ig сироватки крові. На його частку припадає 70-80% всіх сироваткових Ig, при цьому 50% міститься в тканинної рідини. Середній вміст IgG в сироватці крові здорової дорослої людини 12 г / л. Період напіврозпаду IgG - 21 день.

IgG - мономер, має 2 антигензв'язуючих центру (може одночасно свя¬зать 2 молекули антигену, отже, його валентність дорівнює 2), молекулярну масу близько 160 кДа і константу седиментації 7S. Розрізняють підтипи Gl, G2, G3 і G4. Синтезується зрілими В-лімфоцитами і плазматичними клітинами. Добре визначається в сироватці крові на піку первинного і при вторинному імунній відповіді.

Має високу афінність. IgGl і IgG3 пов'язують комплемент, причому G3 активніше, ніж Gl. IgG4, подібно IgE, володіє цітофільностью (тропностью, або спорідненістю, до огрядним клітинам і базофілам) і бере участь у розвитку алергічної реакції I типу. У імунодіагностичних реакціях IgG може проявляти себе як неповне антитіло.

Легко проходить через плацентарний бар'єр і забезпечує гуморальний імунітет новонародженого в перші 3-4 місяці життя. Здатний також виділятися в секрет слизових, в тому числі в молоко шляхом дифузії.

IgG забезпечує нейтралізацію, опсонізації і маркування антигену, здійснює запуск комплемент-опосередкованого цитолізу і антителозависимой клітинно-опосередкованої цитотоксичності.

Імуноглобулін класу М. Найбільша молекула з усіх Ig. Це пентамер, який має 10 антигензв'язуючих центрів, т. Е. Його валентність дорівнює 10. Молекулярна маса його близько 900 кДа, константа седиментації 19S. Розрізняють підтипи Ml і М2. Важкі ланцюги молекули IgM на відміну від інших ізотипів побудовані з 5 доменів. Період напіврозпаду IgM - 5 днів.

На його частку припадає близько 5-10% усіх сироваткових Ig. Середній вміст IgM в сироватці крові здорової дорослої людини становить близько 1 г / л. Цей рівень у людини досягається вже до 2-4-річного віку.

IgM філогенетично - найдавніший імуноглобулін. Синтезується попередниками і зрілими В-лімфоцитами. Утворюється на початку первинного імунної відповіді, також першим починає синтезуватися в організмі новонародженого - визначається вже на 20-му тижні внутрішньоутробного розвитку.

Має високу авідності, найбільш ефективний активатор комплементу класичним шляхом. Бере участь у формуванні сироваткового і секреторного гуморального імунітету. Будучи полімерної молекулою, що містить J-ланцюг, може утворювати секреторну форму і виділятися в секрет слизових, в тому числі в молоко. Велика частина нормальних антитіл і ізоагглютініни відноситься до IgM.

Не минає через плаценту. Виявлення специфічних антитіл изотипа М в сиво¬ротке крові новонародженого вказує на колишню внутрішньоутробну інфекцію або дефект плаценти.

IgM забезпечує нейтралізацію, опсонізації і маркування антигену, здійснює запуск комплемент-опосередкованого цитолізу і антителозависимой клітинно-опосередкованої цитотоксичності.

Імуноглобулін класу А. Існує в сироваткової і секреторною формах. Близько 60% всіх IgA міститься в секретах слизових.

Сироватковий IgA: На його частку припадає близько 10-15% всіх сироваткових Ig. У сироватці крові здорової дорослої людини міститься близько 2,5 г / л IgA, максимум досягається до 10-річного віку. Період напіврозпаду IgA - 6 днів.

IgA - мономер, має 2 антигензв'язуючих центру (т. Е. 2-валентний), молекулярну масу близько 170 кДа і константу седиментації 7S. Розрізняють підтипи А1 і А2. Синтезується зрілими В-лімфоцитами і плазматичними клітинами. Добре визначається в сироватці крові на піку первинного і при вторинному імунній відповіді.

Має високу афінність. Може бути неповним антитілом. Чи не пов'язує комплемент. Не минає через плацентарний бар'єр.

IgA забезпечує нейтралізацію, опсонізації і маркування антигену, здійснює запуск антителозависимой клітинно-опосередкованої цитотоксичності.

Секреторний IgA: На відміну від сироваткового, секреторний sIgA існує в полімерній формі у вигляді ди- або тримера (4- або 6-валентний) і містить J- і S-пeптіди. Молекулярна маса 350 кДа і вище, константа седиментації 13S і вище.

Синтезується зрілими В-лімфоцитами і їх нащадками - плазматичними клітинами відповідної спеціалізації тільки в межах слизових і виділяється в їх секрети. Обсяг продукції може досягати 5 г на добу. Пул slgA вважається найчисленнішим в організмі - його кількість перевищує сумарний вміст IgM і IgG. У сироватці крові не виявляється.

Секреторна форма IgA - основний фактор специфічного гуморального місцевого імунітету слизових оболонок шлунково-кишкового тракту, сечостатевої системи і респіраторного тракту. Завдяки S-ланцюга він стійкий до дії протеаз. slgA НЕ активує комплемент, але ефективно зв'язується з антигенами і нейтралізує їх. Він перешкоджає адгезії мікробів на епітеліальних клітинах і генералізації інфекції в межах слизових.

Імуноглобулін класу Е. Називають також реагинов. Зміст в сироватці крові вкрай невисоко - приблизно 0,00025 г / л. Виявлення вимагає застосування спеціальних високочутливих методів діагностики. Молекулярна маса - близько 190 кДа, константа седиментації - приблизно 8S, мономер. На його частку припадає близько 0,002% всіх циркулюючих Ig. Цей рівень досягається до 10-15 років життя.

Синтезується зрілими В-лімфоцитами і плазматичними клітинами переважно в лімфоїдної тканини бронхолегеневого дерева і шлунково-кишкового тракту.

Чи не пов'язує комплемент. Не минає через плацентарний бар'єр. Володіє вираженою цітофільностью - тропностью до огрядним клітинам і базофілам. Бере участь у розвитку гіперчутливості негайного типу - реакція I типу.

Імуноглобулін класу D. Відомостей про Ig даного изотипа не так багато. Практично повністю міститься в сироватці крові в концентрації близько 0,03 г / л (близько 0,2% від загального числа циркулюючих Ig). IgD має молекулярну масу 160 кДа і константу седиментації 7S, мономер.

Чи не пов'язує комплемент. Не минає через плацентарний бар'єр. Є рецептором попередників В-лімфоцитів.