14.Анаероби та методи їх культивування.

Анаероби (від грецької негативної частки an і аероби) – організми, здатні жити і розвиватися за відсутності вільного кисню і одержують енергію для життєдіяльності за рахунок розщеплення органічних або неорганічних речовин. Більшість анаеробів – мікроорганізми, добре розвиваються при повній відсутності кисню; при зіткненні з повітрям вони гинуть. Серед них збудники правця, газової гангрени, деякі стрептококи та інші хвороботворні мікроорганізми, бактерії, що живуть у кишечнику людини і тварин, маслянокислі бактерії, що живуть в дозріваючому сирі, та ін. Вони називаються облігатними (обов’язковими) анаеробами.

Інші анаероби, так звані факультативні (умовні), можуть жити як без кисню, так і в його присутності. До них відносяться мікроорганізми (дріжджі, збудники черевного тифу, бактерії сибірської виразки і ін.), Деякі найпростіші, а також і багатоклітинні тварини (круглі, плоскі і малощетинкові черв’яки, погонофори, молюски). Анаероби широко поширені в природі і зустрічаються в грунті, мулі, товщі морської води і т. Д.

Дихання, або біологічне окислення, засноване на окисно-відновних реакціях, що йдуть з утворенням АТФ-універсального акумулятора хімічної енергії. Енергія необхідна мікробної клітці для її життєдіяльності. При диханні відбуваються процеси окислення і відновлення: окислення - віддача донорами (молекулами або атомами) водню або електронів; відновлення - приєднання водню або електронів до акцептору. Акцептором водню або електронів може бути молекулярний кисень (таке дихання називається аеробним) або нітрат, сульфат, фумарат (таке дихання називається анаеробним - нітратних, сульфатних, фумаратним).

Анаеробіоз (від грец. АЕГ - повітря + bios - життя) - життєдіяльність, що протікає при відсутності вільного кисню. Якщо донорами і акцепторами водню є органічні сполуки, то такий процес називається бродінням. При бродінні відбувається ферментативне розщеплення органічних сполук, переважно вуглеводів, в анаеробних умовах. З урахуванням кінцевого продукту розщеплення вуглеводів розрізняють спиртове, молочнокисле, уксуснокислое і інші види бродіння.

По відношенню до молекулярного кисню бактерії можна розділити на три основні групи: облігатні, тобто обов'язкові, аероби, облігатні анаероби і факультативні анаероби.

Методи культивування анаеробів.

Для культивування анаеробів необхідно знизити окислювально-відновний потенціал середовища, створити умови анаеробіозу, т. Е. Пониженого вмісту кисню в середовищі і навколишньому її просторі. Це досягається застосуванням фізичних, хімічних і біологічних методів.

Фізичні методи. Засновані на вирощуванні мікроорганізмів в безповітряному середовищі, що досягається:

1) посівом в середовища, які містять редуцирующие і легко окислюються речовини;

2) посівом мікроорганізмів в глибину щільних поживних середовищ;

3) механічним видаленням повітря з судин, в яких вирощуються анаеробні мікроорганізми;

4) заміною повітря в судинах будь-яким індиферентним газом.

Для редукування речовин зазвичай використовують шматочки (близько 0,5 г) тварин або рослинних тканин (печінка, мозок, нирки, селезінка, кров, картопля, вата). Ці тканини пов'язують розчинений в середовищі кисень і адсорбують бактерії. Щоб зменшити вміст кисню в живильному середовищі, її перед посівом кип'ятять 10-15 хв, а потім швидко охолоджують і заливають зверху невеликою кількістю стерильного вазелінового масла. Висота шару масла в пробірці близько 1 см.

Як легко окисляються, використовують глюкозу, лактозу і муравьінокіслий натрій.

Кращою рідким живильним середовищем з редукуючими речовинами є середовище Кітт - Тароцці, яка використовується з успіхом для накопичення анаеробів при первинному посіві з досліджуваного матеріалу і для підтримки зростання виділеної чистої культури анаеробів.

Посів мікроорганізмів в глибину щільних середовищ виробляють за способом Віньяль - Вейона, який складається в механічній захисту посівів анаеробів від кисню повітря. Беруть скляну трубку завдовжки 30 см і діаметром 3-6 мм. Один кінець трубки витягають в капіляр у вигляді пастерівської піпетки, а в іншого кінця роблять перетяжку. У залишився широкий кінець трубки вставляють ватяну пробку. У пробірки з розплавленим і охолодженим до 50 ° С живильним агаром засівають досліджуваний матеріал. Потім насмоктують засіяний агар в стерильні трубки Віньяль - Вейона. Капілярний кінець трубки запаюють в полум'я пальника і трубки поміщають в термостат. Так створюються сприятливі умови для зростання самих строгих анаеробів. Для виділення окремої колонії трубку надрізають напильником, дотримуючись правил асептики, на рівні колонії, ламають, а колонію захоплюють стерильною петлею і переносять в пробірку з живильним середовищем для подальшого вирощування і вивчення в чистому вигляді.

Видалення повітря виробляють шляхом його механічного відкачування зі спеціальних приладів - анаеростатах, в які поміщають чашки з посівом анаеробів. Переносний анаеростатах є товстостінний металевий циліндр з добре притертою кришкою (з гумовою прокладкою), забезпечений відводить краном і вакуумметром. Після розміщення засіяних чашок або пробірок повітря з анаеростатах видаляють за допомогою вакуумного насоса.

Заміну повітря індиферентним газом (азотом, воднем, аргоном, вуглекислим газом) можна виробляти в тих же анаеростатах шляхом витіснення його газом з балона.

Хімічні методи. Засновані на поглинанні кисню повітря в герметично закритій посудині (анаеростатах, ексикаторі) такими речовинами, як пирогаллол або гідросульфіт натрію Na2S204.

Біологічні методи. Засновані на спільному вирощуванні анаеробів зі строгими аеробами. Для цього із застиглої агарної платівки по діаметру чашки вирізають стерильним скальпелем смужку агару шириною близько 1 см. Виходить два агарових напівдиска в одній чашці. На одну сторону агарної платівки засівають аероб, наприклад часто використовують S. aureus або Serratia marcescens. На іншу сторону засівають анаероб. Краї чашки заклеюють пластиліном або заливають розплавленим парафіном і поміщають в термостат. При наявності відповідних умов в чашці почнуть розмножуватися аероби. Після того, як весь кисень в просторі чашки буде ними використаний, почнеться зростання анаеробів (через 3-4 діб). З метою скорочення повітряного простору в чашці живильне середовище наливають можливо більш товстим шаром.

Комбіновані методи. Засновані на поєднанні фізичних, хімічних і біологічних методів створення анаеробіозу.