10.Методи культивування вірусів та їх оцінка.

Для культивування вірусів використовують культури клітин, курячі ембріони і чутливих лабораторних тварин. Ці ж методи використовують і для культивування рикетсій і хламідій - облігатних внутрішньоклітинних бактерій, які не ростуть на штучних поживних середовищах.

Культури клітин. Культури клітин готують з тканин тварин або людини. Культури поділяють на первинні (неперевіваемие), полуперевіваемие і перещеплюваних.

Приготування первинної культури клітин складається з декількох послідовних етапів: подрібнення тканини, роз'єднання клітин шляхом тріпсінізаціі, відмивання отриманої однорідної суспензії ізольованих клітин від трипсину з подальшим суспендированием клітин в живильному середовищі, що забезпечує їх зростання, наприклад в середовищі 199 з додаванням телячої сироватки крові.

Перещеплюваних культури на відміну від первинних адаптовані до умов, що забезпечує їм постійне існування in vitro, і зберігаються протягом декількох десятків пасажів.

Перещеплюваних одношарові культури клітин готують із злоякісних і нормальних ліній клітин, що володіють здатністю тривалий час розмножуватися in vitro в певних умовах. До них відносяться злоякісні клітини HeLa, спочатку виділені з карциноми шийки матки, Нер-3 (з лімфоїдної карциноми), а також нормальні клітини амніону людини, нирок мавпи і ін.

До полуперевіваемие культурам ставляться диплоїдні клітини людини. Вони являють собою клітинну систему, що зберігає в процесі 50 пасажів (до року) диплоїдний набір хромосом, типовий для соматичних клітин використовуваної тканини. Диплоїдні клітини людини не зазнають злоякісного переродження і цим вигідно відрізняються від пухлинних.

Про розмноження (репродукції) вірусів в культурі клітин судять по цитопатичної дії (ЦПД), яке може бути виявлено мікроскопічно і характеризується морфологічними змінами клітин.

Характер ЦПД вірусів використовують як для їх виявлення (індикації), так і для орієнтовною ідентифікації, т. Е. Визначення їх видової приналежності.

Один з методів індикації вірусів заснований на здатності поверхні клітин, в яких вони репродукуються, адсорбувати еритроцити - реакція гемадсорбції. Для її постановки в культуру клітин, заражених вірусами, додають суспензію еритроцитів і після деякого часу контакту клітини промивають фізіологічним розчином хлориду натрію. На поверхні уражених вірусами клітин залишаються прилипли еритроцити.

Інший метод - реакція гемаглютинації (РГ). Застосовується для виявлення вірусів в культуральної рідини культури клітин або хоріоналлантоісной або амніотичної рідини курячого ембріона.

Кількість вірусних частинок визначають методом титрування за ЦПД в культурі клітин. Для цього клітини культури заражають десятикратним розведенням вірусу. Після 6-7-денної інкубації їх переглядають на наявність ЦПД. За титр вірусу приймають найбільше розведення, яке викликає ЦПД в 50% заражених культур. Титр вірусу висловлюють кількістю цитопатичних доз.

Більш точним кількісним методом обліку окремих вірусних частинок є метод бляшок.

Деякі віруси можна виявити і ідентифікувати за включеннями, які вони утворюють в ядрі або цитоплазмі заражених клітин.

Курячі ембріони. Курячі ембріони в порівнянні з культурами клітин значно рідше бувають контаміновані вірусами і мікоплазмами, а також мають порівняно ви¬сокой життєздатністю і стійкістю до різних впливів.

Для отримання чистих культур риккетсий, хламідій. і ряду вірусів в діагностичних цілях, а також для приготування різноманітних препаратів (вакцини, діагностикуми) використовують 8-12-денні курячі ембріони. Про розмноження згаданих мікроорганізмів судять по морфологічних змін, що виявляються після розтину ембріона на його оболонках.

Про репродукції деяких вірусів, наприклад грипу, віспи, можна судити по реакції гемаглютинації (РГА) з курячими або іншими еритроцитами.

До недоліків даного методу відносяться неможливість виявлення досліджуваного мікроорганізму без попереднього розтину ембріона, а також наявність в ньому великої кількості білків і інших з'єднань, що ускладнюють подальшу очистку риккетсий або вірусів при виготовленні різних препаратів.

Лабораторні тварини. Видова чутливість тварин до певного вірусу і їх вік визначають репродуктивну здатність вірусів. У багатьох випадках тільки новонароджені тварини чутливі до того чи іншого вірусу (наприклад, миші-сисунці - до вірусів Коксакі).

Перевага даного методу перед іншими полягає в можливості виділення тих вірусів, які погано репродукується в культурі або ембріоні. До його недоліків відносяться контамінація організму піддослідних тварин сторонніми вірусами і мікоплазмами, а також необхідність подальшого зараження культури клітин для отримання чистої лінії даного вірусу, що подовжує терміни дослідження.