63.Методи лабораторної діагностики вірусних інфекцій: реакція гальмування гемаглютинації, її механізм, умови постановки, принципи застосування, діагностична цінність.

Для лабораторної діагностики вірусних інфекцій використовуються різні методи.

Вірусологічне дослідження (світлова мікроскопія) дозволяє виявити характерні вірусні включення, а електронна мікроскопія – самі віріони, і за особливостями їх будови діагностувати відповідну інфекцію (наприклад, ротавирусную).

Вірусологічне дослідження спрямоване на виділення вірусу і його ідентифікацію. Для виділення вірусів використовують зараження лабораторних тварин, курячих ембріонів або культури тканин. Первинну ідентифікацію виділеного вірусу до рівня сімейства можна провести за допомогою: визначення типу нуклеїнової кислоти (проба з бромдезоксіурідоном), особливостей її будови (електронна мікроскопія), розміром віріона (фільтрування через мембранні фільтри з порами діаметром 50 і 100 нм), наявності суперкапсідную оболонки (проба з ефіром), гемагглютининов (реакція гемаглютинації),

типу симетрії нуклеокапсида (електронна мікроскопія).

Вірусологічне дослідження – це «золотий стандарт» вірусології і має проводиться в спеціалізованій вірусологічної лабораторії. В даний час воно використовується практично тільки в умовах виникнення епідемічного спалаху того чи іншого вірусного інфекційного захворювання. Для діагностики вірусних інфекцій широке застосування знайшли методи иммунодиагностики (серодиагностики і іммуноіндікаціі). Вони реалізуються в найрізноманітніших реакціях імунітету: радіоізотопний імунний аналіз (РІА), імуноферментний аналіз (ІФА), реакція імунофлюоресценції (РІФ), реакція зв’язування комплементу (РСК), реакція пасивної гемаглютинації (РПГА), реакції гальмування гемаглютинації (РГГА) та інші.

При використанні методів серодиагностики обов’язковим є дослідження парних сироваток. При цьому чотириразове наростання титру антитіл у другій сироватці в більшості випадків служить показником протікає або свежеперенесенной інфекції. При дослідженні однієї сироватки, взятої у гострій стадії хвороби, діагностичне значення має виявлення антитіл класу Ig М, яке свідчить про гостру інфекції.

РГА – це склеювання еритроцитів під дією вірусів. На поверхні деяких складних вірусів є рецептори – гемаглютиніни. Віруси адсорбуються на поверхню еритроцитів і завдяки гемаглютинінам викликають склеювання еритроцитів і утворення осаду з нерівним краєм.

РГадсорбціі – складні віруси при виході з клітини змінюють її мембрану, відбувається від брунькування.

До цих змінених місць можуть прикріплятися еритроцити.

Реакція гемаглютинації – феномен склеювання еритроцитів під впливом вірусів. Позитивна реакції – осад у вигляді «парасольки», негативна – у вигляді «гудзика».

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА). Реакція базується на здатності блокувати гемаглютинуючі властивості вірусів за допомогою специфічних антитіл. У результаті цього спостерігається затримка аглютинації еритроцитів.

Компонентами реакції є невідомі антигени (вірусмісткий матеріал), який може бути збагачений пасажами в культурі клітин, лабораторних тваринах або курячому ембріоні, специфічні імунні противірусні (або проти окремих вірусних антигенів) сироватки, еритроцити. Для розведення компонентів реакції використовують забуферений фізіологічний розчин (рН 7,2-7,4). Еритроцити отримують із крові птахів (кури, гуси), ссавців (гвінейські свинки), людини (0 група). Їх тричі промивають у стерильному фізіологічному розчині та зберігають у вигляді 0,5-1,0 % суспензії. З метою їх стабілізації еритроцити попередньо обробляють формаліном або глутаровим чи акриловим альдегідом.

Імунні сироватки попередньо позбавляють неспецифічних інгібіторів, прогріваючи при температурі 56 °С протягом 30 хв (для видалення термолабільних інгібіторів) або обробляючи розчинами перйодату калію чи натрію, бентонітом, каоліном, етакридину лактатом та іншими.

Реакцію ставлять у пробірках або спеціальних полістиролових планшетах з луночками. Постановці реакції передує визначення активності вірусного антигена, який титрують за допомогою РГА. У досліді використовують робочу дозу антигена, яка дорівнює від 4 до 8 ГАО (ГАО – гемаглютинуюча одиниця – максимальне розведення антигена, яке повністю аглютинує стандартну суспензію еритроцитів). Позитивною реакцією вважають утворення червоного зернистого з нерівними краями осаду, який дифузно розташовується на дні пробірки. Про негативний результат свідчить наявність компактного осаду у вигляді “ґудзика” на дні пробірки або лунки, який може стікати при її нахиленні. При частковій аглютинації утворюється осад у вигляді кільця.

Реакція гальмування гемадсорбції (РГГ_адс). Принцип реакції базується на явищі гемадсорбції. Воно полягає в тому, що еритроцити набувають здатності адсорбуватись на поверхні культур клітин, які зазнали модифікації внаслідок появи в оболонці глікопротеїнів вірусів. Антитіла імунної сироватки при взаємодії з поверхневими антигенами вірусів, представленими в оболонці, зв’язують їх, внаслі­док чого гальмується адсорбція еритроцитів на клітинах.

Компонентами реакції є віруси, здатні до гемадсорбції, культура клітин, в якій вони розвиваються, противірусна сироватка з розведенням 1:10 і більше, 0,4‑1,0 % завись еритроцитів півня, гвінейської свинки або людини, тричі відмита фізіологічним розчином або розчином Хенкса. Специфічні сироватки, які використовують у досліді, попередньо обробляють ферментами, які руйнують рецептори, піддають температурному впливу, щоб звільнити від неспецифічних інгібіторів гемаглютинації.

Реакцію ставлять у пробірках або на спеціальних скляних пластинах, на яких є моношар культури клітин. Одна з переваг РГГ_адс полягає в тому, що її можна ставити до появи цитопатичного ефекту.

Попередньо заражають культуру клітин вірусмістким матеріалом та інкубують протягом деякого часу залежно від властивостей вірусу. Як контроль використовують культуру клітин, неінфіковану вірусами. Безпосередньо перед дослідом з пробірок видаляють живильне середовище, відмивають клітини від баластних речовин (білків) розчином Хенкса. У кожну дослідну пробірку додають по 0,6 мл розчину Хенкса і по 0,2 мл противірусної сироватки. У контрольні пробірки вносять по 0,8 мл розчину Хенкса та неімунну сироватку тварин. Пробірки інкубують нахиленими, щоб живильне середовище і сироватка омивали клітини, при кімнатній температурі протягом 15-30 хв. Потім в усі пробірки додають по 0,2 мл 0,4 % зависі еритроцитів, інкубують ще 20-30 хв при кімнатній температурі. Після цього пробірки обережно обертають в долонях 5-10 разів для ресуспендування еритроцитів та видалення їх з моношару культур клітин. Розглядаючи пробірки під малим збільшенням мікроскопа, звертають увагу на наявність чи відсутність адсорбції еритроцитів на поверхні клітин. При позитивній РГГ_адс еритроцити вільно плавають у живильному середовищі, при негативній – вони адсорбуються на клітинах. РГГ_адс використовують для ідентифікації збудників парагрипу, паротиту, респіраторно-синцитіальних вірусів та ін.