Вопрос 101: Лабораторная диагностика сифилиса.

Микроскопическое исследование. При первичном сифилисе, на бледную трепонему исследуют отделяемое шанкров или пунктат регионарных лимфатических узлов, при вторичном сифилисе - материал из различных поражений кожи и слизистых оболочек.

Материал для исследования получают от больного до лечения непосредственно в лаборатории. Для получения материала поверхность язвы протирают ватой, смоченной стерильным изотоническим раствором хлорида натрия, затем дно язвы слегка раздражают платиновой лопаточкой, предварительно прокаленной на огне и охлажденной. Для большого выделения тканевой жидкости пальцами в резиновой перчатке сдавливают плотное основание язвы.

Исследуемую тканевую жидкость вносят лопаточкой в каплю изотонического раствора хлорида натрия на предметном стекле, смешивают, накрывают покровным стеклом и исследуют в оптическом микроскопе с темнопольным конденсатором. Между линзой конденсатора и предметным стеклом должна быть капля дистиллированной воды.

Пунктат из лимфатического узла получают в асептических условиях при помощи шприца с толстой иглой, содержащего несколько капель изотонического растворе хлорида натрии. Фиксируя иглу пальцами в лимфатическом узле, ее слегка раскачивают для разрушения окружающей ткани, вводят имеющийся в шприце изотонический раствор хлорида натрия, а затем отсасывают материал для исследования.

Если исследование производит не тотчас, то материал в запаянном капилляре помещают в термостат для сохранения подвижности трепонем. В таком виде его можно пересылать и в другие лаборатории, так как жизнеспособность трепонем в указанных условиях может сохраняться до 1-2 нед. Для более длительного сохранения используют консервирующий раствор, состоящий из 10 мл 40 % формалина и 90 мл фосфатного буфера. При этом трепонемы сохраняют свои морфологические особенности и могут быть обнаружены в натинном или окрашенном препарате.

При микроскопическом исследовании бледные трепонемы имеют вид тонкой спирали с истонченными концевыми отделами. Завитки в середине тела расположены теснее, чем на концах. В тёмном поле зрения микроскопа можно наблюдать поступательное вращение трепонемы вокруг оси, скользящее вперед и назад, сгибание тела в стороны. По Романовскому – Гимзе они окрашиваются в нежно розовый цвет.

При исследовании препарата на бледную трепонему нужно учитывать возможность обнаружения в нем не сифилитических трепонем.

Серологическая диагностика: в состав комплекса серологических реакций, предназначенного для диагностики данного заболевания, входит РСК с трепонемным и кардиолипиновым антигенами, а также микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном. Кроме того, микрореакция изолированно используется в качестве отборочного теста на сифилис. Инструкция предусматривает применение для серодиагностики сифилиса и для распознавания биологически ложноположительных результатов, полученных в тестах с липоиднымиантигенами, и РИБТ, и РИФ в различных модификациях.

В связи с тем что каждая реакция имеет свою специфику, профилактическое обследование населения на сифилис рекомендуется проводить с помощью микрореакции или КСР, причем доноры и беременные, включая направляемых на искусственное прерывание беременности, а также больные психиатрических и неврологических стационаров должны обследоваться только с использованием КСР, что обусловлено более высокой чувствительностью реакции связывания комплемента с трепонемным антигеном по сравнению с липоидными тестами при поздних формах сифилиса.

Реакция связывания комплемента: в основу положены феномены бактериолизиса и гемолиза, причем гемолитическая система является индикатором процесса, происходящего между основными антигеном и антителом.

Контрольные лиофилизиронанные сыворотки крови. Отрицательную и положительную сыворотки крови используют неразведенными, слабоположительную получают из положительной путем ее разведения по титру, установленному в день приготовления эмульсии антигена. В день постановки реакции положительную сыворотку крови титруют на пластинке для контроля качества эмульсии и получения слабоположительного результата, который используют затем в течение рабочего дня в качестве контроля.

Титрование проводят следующим образом: в 9 лунок пластинки, начиная со второй лунки, вносят по 3 капли изотонического раствора хлорида натрия и добавляют в первую и вторую лунки по 3 капли положительной сыворотки крови. Содержимое второй лунки перемешивают пастеровской пипеткой, насасывая и выпуская его в лунку 5—6 раз. Затем набирают часть содержимого второй лунки в пастеровскую пипетку и 3 капли переносят в третью лунку, а оставшуюся в пипетке сыворотку крови возвращают во вторую лунку. Содержимое третьей лунки перемешивают таким же образом и 3 капли переносят в четвертую лунку и так далее до последней лунки. Из последней лунки 3 капля удаляют. Во все лунки добавляют по одной капле эмульсии кардиолипинового антигена. Пластинку встряхивают ручным способом или в аппарате для встряхивания в течение 5 мин, добавляют по 3 капли изотонического раствора хлорида натрия и оставляют при комнатной температуре на 5 мин, после чего регистрируют результаты. Разведение сыворотки крови, давшее слабоположительный результат, используют в качестве слабоположительного контроля. Для его получения делают соответствующее разведение.

При правильно проведенном титровании положительной сыворотки крови по мере ее разведения равномерно уменьшается величина хлопьев преципитата.

Реакция иммобилизации бледных трепонем.

Этапы реакции: кролика заражают патогенными бледными трепонемами в яичко. При развитии специфического орхита удаляют яичко и получают из него взвесь бледных трепонем, которые служат антигеном в реакции. По определенной методике их соединяют с исследуемой сывороткой крови и комплементом в специальной среде и выдерживают в анаэробных условиях при 35°С.

Через 18—20 ч результаты реакции учитывают при помощи оптической микроскопии с темнопольным конденсором. При этом сравнивают процент подвижных трепонем в пробирке, содержащей исследуемую сыворотку крови и активный комплемент и в пробирке с инактивированным комплементом. В контрольных пробирках 90%. трепонем остаются подвижными, в опытных число подвижных трепонем зависит от отсутствия или наличия специфических антител и их концентрации.

Реакция иммунофлюоресценции

Суть реакции при выявлении специфических антител заключается в том, что соответствующий известный антиген фиксируется на предметном стекле, в первой фазе реакции на него наносят исследуемую сыворотку крови. При наличии в ней специфических антител образуется комплекс антиген — антитело, который при промывке препарата не удаляется, так как антиген фиксирован на стекле. Во второй фазе реакции препарат обрабатывают антивидовой люминесцирующей сывороткой, меченые антитела которой соединяются с комплексом антиген — антитело при условии его образования в первой фазе реакции. После промывки, высушивания и монтирования препараты исследуют в люминесцентном микроскопе, так как антивидовую сыворотку метят флюоро-хромом. Свечение антигена указывает на положительный результат реакции.

Иммуноферментный анализ.

По механизму реакции, чувствительности и специфичности ИФА близок к РИФ, но отличается от нее тем, что антиген может быть не корпускулярным, а для метки антивидовой иммунной сыворотки вместо флюорохрома используется фермент, чаще пероксидаза или щелочная фосфатаза. Антигеном сенсибилизируют пробирки, лунки пластин, шарики либо палочки из полистирола, поливинилхлорида, акрила или других носителей. Исследуемые сыворотки крови сорбируют для удаления неспецифических антител, в первой фазе реакции на антиген наносят исследуемую сыворотку крови, во второй фазе — антивидовой конъюгат, в третьей фазе субстрат для выявления фермента.

Образование комплексов антиген — антитело на поверхности твердофазного носителя и обнаружение химическим путем фермента позволяет оценивать результаты ИФА визуально по степени изменения окраски субстрата под действием фермента, входящего в состав конъюгата.