Методы диагностики инфекцииHelicobacterpylori

Сегодня не подвергается сомнению патологическая роль в этиопатогенезе большинства гастродуоденальных заболеваний «спиралевидных бактерий» (Helicobacter pylori), выделенных и описанных в 1983 годуJ.R.WarrenиB.J.Marshall(рис. 5. 91). На сегодняшний день получены убедительные доказательства участияH.pyloriв повреждении слизистой оболочки желудка при гастрите, язвенной болезни обеих локализаций, дуодените, неязвенной диспепсии. Кроме того, получены доказательства о значенииH.pyloriкак одного из факторов риска развития рака желудка и неходжкинских лимфом гастродуоденальной зоны.

Для диагностики инфекции H.pyloriпредложено множество различных методов, причем большинство из них постоянно модифицируется. Следует отметить, что выбор метода исследования на инфицированностьH.pylori, или их комплекса, зависит от конкретных задач врача или исследователя. Наиболее рациональной представляется классификация методов, указанная выше(см. табл. 5.5).

Бактериологический методисследования инфекцииН. pylori,являясь прямым и инвазивным методом диагностики хеликобактериоза специфичен на уровне 95-100%, при чувствительности - 80-90%. Для культивированияН. pyloriприменяются среды, которые позволяют транспортировать биопсийный материал в течение суток (среда Стюарта, Кэри-Блер, Био Мерьо). Далее испытуемый образец ткани высевается на искусственные питательные среды: а) неселективные (агар Колумбия) и б) селективные, содержащие ванкомицин, триметоприм, полимиксин) для подавления сопутствующей микрофлоры. После высевания ожидаемая культура подвергается инкубации в течение 3-5 суток. Инкубация проходит в микроаэрофильных условиях при температуре 37˚С и влажности 100%..

Оценка проводится полуколичественным методом, в зависимости от числа выросших изолированных колоний: до 10 колоний (+), 10-20 колоний (++), 20-50 колоний (+++), свыше 50 колоний (++++). Кроме того, выделенные культуры идентифицируются как Н. pyloriпо морфологическим (при окраске по Граму) и биохимическим критериям (определение уреазной, каталазной, оксидазной активности, способности бактерии не ферментировать глюкозу, не продуцировать нитраты и не образовывать индол).

Очень важной особенностью бактериологического метода определения инфицирования Н. pyloriявляется возможность с его помощью определить устойчивость к антибактериальным препаратам, проводить клинические испытания новых лекарственных антибактериальных препаратов направленных на эрадикациюН. pylori.

Морфологические методы. “Золотым стандартом” диагностики НР-инфекции являетсягистологический метод. Специфичность данного прямого, инвазивного метода исследования оценивается на уровне 97%, а чувствительность - 80-90%. Для проведения гистологического исследования наН. pyloriбиопсийный материал окрашивают акридиновым оранжевым, по Гимзе, Граму, толуидиновым синим, серебрением по Вартину-Старри и др. Наиболее простым и доступным методом выявленияН. pyloriявляется окраска по Гимзе без дифференцировки. Микроорганизмы при этом окрашиваются в темно-синий цвет и хорошо визуализируются как на поверхности эпителия, так и в глубине ямок.

При оценке гистологических препаратов обычно выделяют З степени обсеменения слизистой оболочки: а) слабая степень (+) - до 20 микробных тел в поле зрения при увеличении Х 630; б) средняя степень (++) - от 20 до 50 микробных тел в поле зрения; в) высокая степень (+++) - более 50 микробных тел в поле зрения.

Несомненным преимуществом данного метода является не только возможность верификации микробного обсеменения слизистой, но и оценка состояния последней (воспаление, атрофия, метаплазия и др.).

В последнее время разработан новый наиболее чувствительный иммуногистохимический метод обнаружения Н. pyloriс применением моноклональных антител и комплекса авидин-биотин-пероксидазы.

К перспективным высокочувствительным и специфичным методам выявления Н. pyloriотносится и метод гибридизации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в обычных парафиновых срезах. Метод позволяет идентифицировать различные штаммыН. pylori, помогая выяснять природу рецидивов после успешной эрадикацииН. pylori.

Цитологический методопределенияН. pyloriв мазках-отпечатках также относится к прямым, инвазивным методам. Преимуществом данного метода является его меньшая трудоемкость по сравнению с гистологическим исследованием, что значительно сокращает время получения результатов. Существует несколько разновидностей данного метода: а)crush cytology(раздавливание биоптата); б)imргint или touch суto1ogy(прикосновение и отпечаток люминальной поверхности биоптата к предметному стеклу); в)brush cytology(получение пристеночной слизи с помощью специальной щеточки, входящей в комплект современных эндоскопов). Биопсия обычно берется из участков с наиболее выраженными визуальными отклонениями от нормы (гиперемия, отек), но не из дна язв или эрозий.

Высушенные мазки окрашиваются по Граму, Папенгейму, красителем Романовского-Гимзы или после фиксации метанолом-азур-эозиновой смесью. Применяемые паноптические методы окраски позволяют выявить наличие Н. pyloriи ориентировочно оценить количество микроорганизмов. Как правило,Н. pyloriрасполагаются в слизи, имеют спиралевидную, изогнутую форму, могут быть иS-образными, кокковидными.

Кроме обнаружения Н. pyloriв мазках-отпечатках могут выявляться ассоциированные сН. pyloriявления клеточной инфильтрации, характеризующейся наличием лимфоцитов, плазматических клеток, нейтрофилов и эозинофилов. По преобладанию тех или иных клеточных элементов можно косвенно судить об активности и выраженности воспаления. Цитологическое исследование позволяет также выявлять морфологические особенности строения ядер и цитоплазмы клеток слизистой оболочки желудка и ДПК, наличие пролиферативньих процессов, злокачественного образования, метаплазии, дисплазии и степень их выраженности. Однако этот метод не дает информации о структуре исследуемой слизистой.

Следует помнить, что Н. pyloriколонизирует только эпителий желудочного типа и в участках кишечной метаплазии его не обнаруживается, одновременно в ДПК забор биопсии в участках желудочной метаплазии может дать положительный результат. Отсутствует Н. pyloriи в краях язвенных дефектов желудка и ДПК. Особенно сложно выявитьН. pyloriпосле лечения антисекреторными препаратами (блокаторами протонной помпы), препаратами висмута, антибиотиками. При длительном применении блокаторов протонной помпыН. pyloriмогут переселяться в зону желудочного кислотообразования, проксимально. Для исключения ложноотрицательных результатов необходима множественная биопсия (5-7 биоптатов).

Биохимические методы. Н. pyloriобладает уникальной способностью продуцировать уреазу, разлагающую мочевину до углекислого газа и ионов аммония. Биохимический метод определения уреазной активности включает в себябыстрый уреазный и дыхательный тесты.Данные методы исследования инвазивные но не прямые, а их относительная специфичность основана на высоком уровне продукции уреазы, свойственнойН. pylori, в отличие от других присутствующих в желудке и ДПК микроорганизмов продуцирующих уреазу.

Инфицированность слизистой оболочки Н. pyloriоценивается полуколичественным методом в зависимости от появления малинового окрашивания (изменение рН в присутствии индикатора). Определение проводится в течение первого часа, последующих 2 часов и к концу первых суток. Если окрашивание наступает в более поздние сроки - результат считается отрицательным(рис. 5.92).В настоящее время имеются уреазные тесты промышленного производства (де-Нол тест, СLOтест, РуlогiТеk, НUТ-тест и др.). Чувствительность этих методов на уровне 64-99%, а специфичность - 75-95%.

Достоинствами уреазных тестов является простота их выполнения, относительная дешевизна и быстрота. Однако метод не лишен и недостатков, среди них: неустойчивость растворов при хранении, необходимость в ряде случаев термостатирования, длительность реакции до суток, возможность как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов, особенно при низкой степени обсемененности НР и использования одного фрагмента ткани слизистой оболочки.

Кроме перечисленных тестов существует и количественный спектрофотометрический метод определения уреазной активности в биоптатах, который позволяет количественно определять уреазную активностьН. pylori, что особенно важно при незначительной степени обсеменения слизистойН. pylori,при которых вышеописанные тесты могут давать сбои.

На определении уреазной активности Н. pyloriоснованы также неинвазивные, косвенные радионуклидньие методы диагностики НР- инфекции - неинвазивные и косвенные. К ним относятся уреазньие дыхательные тесты с мочевиной, меченной изотопами углерода¹³С или¹⁴С.¹⁴С является радиоактивным изотопом и его применение имеет ряд ограничений и соответствующих гигиенических и технических условий. В отличие от¹⁴С¹³С не радиоактивен, поэтому методика с его использованием наиболее распространена. Меченая¹³С мочевина дается пациенту в составе пробного завтрака. УреазаН. pyloriразлагает мочевину до углекислого газа, сохраняющего меченый углерод. Приращение в выдыхаемом воздухе¹³СО₂фиксируется с помощью масс-спектрометра. В норме содержание стабильного изотопа не превышает 1% от общего количества СО₂в выдыхаемом воздухе. При инфицированностиН. pyloriрегистрируется 4 ее степени: легкая - менее 3,5%, средняя - 3,5-6,4%, тяжелая - 6,5-9,4% и крайне тяжелая степень, при количестве СО₂ - более 9,5%.

Этот дыхательный тест с успехом может быть использован для обследования детей, при эпидемиологических исследованиях больших контингентов населения, а также у больных, которым противопоказано проведение эндоскопической процедуры.

Дыхательные тесты не подвержены ошибкам, связанным с особенностями методов, использующих гастробиоптаты, так как дают представление об уреазной активности со всей поверхности слизистой, позволяют косвенно оценивать степень ее колонизации и являются диагностически значимыми для контроля за эрадикацией Н. pylori. Ограничивает широкое внедрение данной методики только высокая стоимость масс-спектрометра. Однако, в последнее время, появились сообщения о появлении в лабораторном техничском арсенале более дешевых приборов для регистрации данных дыхательных тестов, на основе применения лазерной техники, что значительно удешевит методику исследования.

Маастрихтским соглашением – 3, определено, что основу диагностики Н. pyloriсоставляют Неинвазивные методы и, в частности,¹³С дыхательный тест, который имеет преимущества перед тестом по антигену в кале (см. ниже).

Выявление Н. pyloriв гастробиоптатах можно проводить и иммуногистохимически с использованием моноклональных антител со 100% успехом.

В нашей стране получил распространение аэротест на Н. pylori, основанный на регистрации аммиака в выдыхаемом воздухе. Аммиак образуется в организме человека в результате жизнедеятельностиН. pyloriи регистрируется с помощью газоанализатора. Е.А. Корниенко и В.Е. Милейко предложили новый способ диагностики инфекцииН. pylori, основанный на оценке прироста уровня аммиака в выдыхаемом воздухе до и после приема пациентом карбамида нормального изотопного состава. Модификация аэротеста получила название ХЕЛИК-тест. Его чувствительность составляет 95%, а специфичность - 96%.

Среди инвазивных методов диагностики Н. pyloriу больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки высокой чувствительностью и специфичностью обладают: гистологический, бактериологический методы, а уреазный тест характеризуется умеренной чувствительностью и специфичностью.

Иммунологические методы.Известно, что через 3-4 недели после инфицированияН. pyloriнаблюдается специфический гуморальный иммунный ответ против его антигенов. Образующиеся антитела могут быть определены в сыворотке крови больного различными серологическими методами (реакции агглютинации, непрямой гемагглютинации, преципитации и др.). Самым распространенным методом являетсяиммуноферментный анализ(ИФА) -ELISA(enzime-linkedimmunosorbentassay). Данный метод является косвенным и неинвазивным. Чувствительность указанного метода находится в пределах 93-100%, а специфичность составляет 93-95%. Этим тестом выявляют антитела классов IgM,IgG,IgA, чащеIgG, в сыворотке крови, ко многим антигенамН. pylori. Также этим методом можно определять секреторные IgAи IgMв слюне и содержимом желудка.

С помощью ИФА можно косвенно оценить патогенность штаммов Н. pylori(в частности определить СаgA-статус) и осуществлять многие годы наблюдение за больными после курса лечения. Необходимо помнить, что в ранние сроки инфицирования (в течение первого месяца), результат ИФА отрицателен. Кроме того, тест остается положительным еще как минимум 4-6 недель после успешной эрадикацииН. pylori, а оценку динамики уровня антител необходимо проводить не ранее 6 месяцев после лечения.

Одной из последних разработок было создание экспресс-тестов, позволяющих провести качественную оценку поливалентного гуморального иммунного ответа на комплекс антигенов Н. pylori. Данные тесты основаны на латекс агглютинации или твердофазном ИФА. В качестве источника исследуемого материала используется капиллярная кровь из пальца, а результат читается через несколько минут.

Среди наиболее специфичных и чувствительных, выделяются тесты, основанные на применении иммунного блоттинга. С их помощью могут быть выявлены антитела классов IgM, IgG, IgAк различным антигенам НP, в том числе, к тем из них, антитела к которым не выявляются с помощью иных методик.

В 2000 году была разработана тест-система для определения концентрации антигена Н. pyloriв кале с помощью количественного ИФА. Результат считается положительным при появлении яркого желтого окрашивания смеси исследуемой пробы. Интенсивность цвета оценивается спектрофотометрически.

Одной из последних разработок является тест URINELISAН.руlогi Аntibody, основанный на твердофазном ИФА, с помощью которого можно определять антитела к антигенамН. pyloriв моче. Последние рекомендации (Маастрихт – 3) дляскрининга Н. pylori отдают преимущество именно тестам с определением антихеликобактерных антител в слюне и моче.

Молекулярные методы.Метод полимеразной цепной реакции(ПЦР), предложенный в 1983 году, за открытие которого в 1993 году американцу Кагу В. Мullisбыла присуждена Нобелевская премия по химии, в настоящее время активно внедряется в практику, в частности для верификации инфицированияН. pylori. Чувствительность и специфичность ПЦР на уровне 95-100%. Метод идентификацииН. pyloriс помощью ПЦР основан на выявлении фрагмента того или иного гена микроорганизма (саgА,ureC,vасА и др.). Уникальность данного молекулярно- генетического метода диагностики не только в высокой специфичности, но и в том, что материалом для него является любой биологический материал (биоптаты слизистой оболочки желудка и ДПК, желудочный сок, смывы из полости рта, зубной налет, копрофильтраты и т.п.). ПЦР позволяет выявлять, дифференцировать штаммы бактерий между собой по различным признакам, в том числе по факторам патогенности, определять резистентность к антибиотикам.

Маастрихтский консенсус-3 определил как наиболее оптимальный для настоящего времени метод диагностики Н. pylori– дыхательный тест с мочевиной, меченной С¹³. В его отсутствие, для диагностики инфекцииН. pyloriу больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки возможно применять сочетание гистологического метода и уреазного теста, с помощью которых достаточно информативно можно выявить микроорганизм, а также оценить степень обсемененности и морфологические изменения слизистой оболочки.