СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ И ОРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ»

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ АТФ-ЗАВИСИМЫХ ПРОТЕИНАЗ У РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ДЕЙСТВИИ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ

Е. П. Колотова, студ. 5 курса

Научный руководитель – чл.-корр. РАН, д. б. н., проф. Н. Н. Немова, Научный консультант – д. б. н. В. В. Таланова

При действии неблагоприятных факторов внешней среды у растений происходит целый комплекс структурно-функциональных изменений, значительная часть которых носит защитно-приспособительный характер. В настоящее время довольно хорошо изучена роль протеолитических ферментов в защитных реакциях растений на действие биотических факторов. В отличие от этого их участие в адаптивных реакциях растений на действие абиотических факторов среды, в том числе низких температур и тяжелых металлов, практически не изучено.

Протеолитические ферменты, как известно, участвуют в регуляции биологических процессов на разных уровнях организации – молекулярном, субклеточном, клеточном, тканевом, органном [2; 38–43; 4]. Их биологические функции связаны с образованием, инактивацией, модификацией белковых молекул, реализацией и регуляцией важнейших клеточных функций, регуляцией различных физиологических процессов с гормональной координацией функционирования клеточных систем [3]. Первостепенная роль принадлежит протеиназам в реализации межклеточных взаимодействий, координации функционирования различных клеточных систем организма и генерализации биологических процессов [5; 81–87]. Помимо этого протеолитические ферменты принимают участие в протеолизе.

Как в эукариотических, так и в прокариотических клетках механизм протеолиза связан работой различных АТФ-зависимых протеиназ. В митохондриях и хлоропластах растительных клеток были обнаружены АТФ-зависимые протеиназы Clp и Lon, которые относятся к классу сериновых протеиназ [1; 579–587]. Их роль в реакции растений на действие стресс-факторов мало изучена.

В связи с этим целью данного исследования явилось изучение экспрессии генов АТФ-зависимых протеиназ у растений пшеницы при раздельном и совместном действии стресс-факторов различной природы.

385

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

−изучить влияние низкой температуры, кадмия и их совместного действия на ростовые показатели растений пшеницы;

−изучить влияние кадмия на проницаемость мембран клеток листьев растений пшеницы;

−изучить экспрессию генов, кодирующих Clp-протеиназу и Lonпротеиназу у растений пшеницы при действии низкой температуры, кадмия и их совместном действии.

В качестве объекта исследования были использованы проростки пшеницы сорта Московская 39, выращенные в течение 7 суток в камере искусственного климата при постоянных условиях.

Проростки подвергали раздельному или совместному действию низкой положительной температуры (4ºС) и кадмия (в форме сульфата), сохраняя прочие условия среды неизменными. О реакции растений на действие низкой температуры и кадмия судили по изменению ростовых показателей (высота растений, длина и ширина листьев, длина корня), которые изучали стандартными методами. Проницаемость мембран клеток листьев оценивали по выходу электролитов из них с помощью кондуктометрического метода. Экспрессию генов АТФ-зависимых протеиназ в листьях растений проводили с помощью метода ПЦР в реальном времени.

В первой серии экспериментов было изучено изменение ростовых показателей растений пшеницы под влиянием кадмия и низкой температуры. Установлено, что реакция растений пшеницы на действие сульфата кадмия зависит от его концентрации. Действие низких концентраций кадмия (50 и 100 мкМ) в течение 7 суток меньше влияет на рост первого

ивторого листьев, чем высокие концентрации (200 и 500 мкМ). Наибольшее ингибирующее действие оказывает соль кадмия в концентрации 500 мкМ. В этом случае п рирост вторых листьев был незначительным, а к концу эксперимента наблюдалось их увядание. Следовательно, наиболее чувствительными к воздействию ионов кадмия оказались более молодые вторые листья.

Изучение изменения ростовых показателей растений пшеницы при действии низкой температуры показало, что температурный фактор, так же как и кадмий, оказывает ингибирующее действие на рост, однако полного его подавления не происходит.

Совместное действие факторов оказывает наибольшее негативное воздействие на ростовые процессы как первого, так и второго листьев.

386

У многих растений при этом воздействии практически полностью ингибировался рост второго листа.

Во второй серии экспериментов изучали влияние кадмия на проницаемость клеточных мембран по выходу электролитов из высечек листьев. Была установлена следующая зависимость: с увеличением концентрации тяжелого металла повышалась проницаемость мембран. Данный факт свидетельствует о повреждающем действии кадмия.

В результате изучения ростовых показателей и проницаемости мембран пшеницы было установлено, что сульфат кадмия в низкой концентрации (100 мкМ) и температура (4ºС) не оказывают повреждающего воздействия, а растения адаптируются к этим факторам. Для выяснения роли АТФ-зависимых протеиназ в адаптации растений к действию указанных неблагоприятных факторов среды в третьей серии экспериментов был изучен характер экспрессии кодирующих их генов (Clp и Lon).

Установлено, что уровень экспрессии гена ClpP достиг наибольшей величины уже через 15 мин действия соли кадмия и затем постепенно снижался. Спустя сутки воздействия уровень экспрессии был минимальным, но в последующие дни эксперимента он возрастал. Индукция экспрессии гена Lon1 в листьях пшеницы происходила медленнее (максимума она достигла через 1 час), затем ее уровень снижался. На 2-е сутки экспрессия гена начала возрастать и сохранялась примерно на одном уровне в течение последующих дней воздействия сульфата кадмия.

При действии низкой температуры характер экспрессии этих генов был иным. Уровень экспрессии гена ClpP достиг наибольшей величины через 1 час действия кадмия, затем резко снизился. Спустя 5 часов он стал постепенно повышаться. Данная тенденция прослеживалась до окончания воздействия (повышение продолжалось в течение 7 суток). Уровень экспрессии гена Lon1 в листьях пшеницы достиг максимального значения лишь на 2-е сутки, после чего последовало его постепенное снижение.

При совместном действии стресс-факторов уровень экспрессии гена ClpP на протяжении первых суток воздействия повышался незначительно. На 2 -е сутки он достиг наибольшей величины, после чего прослеживалась тенденция к постепенному снижению экспрессии. Уровень экспрессии гена Lon1 в листьях пшеницы достиг максимального значения на 3-и сутки и в последующие дни резко не изменялся.

На основании результатов исследований были сделаны следующие выводы.

387

1.Кадмий в низких концентрациях вызывает незначительные изменения ростовых показателей растений пшеницы. Резко выраженное отрицательное влияние на рост растений зафиксировано при использовании кадмия в высоких концентрациях. Раздельное и совместное действие низкой температуры и сульфата кадмия приводит к торможению ростовых процессов растений пшеницы.

2.При действии кадмия в высоких концентрациях повышается проницаемость мембран клеток листьев растений пшеницы. При низких концентрациях кадмия нарушения проницаемости мембран не происходит, что свидетельствует об адаптации растений к действию указанного фактора.

3.Наиболее заметные изменения в экспрессии АТФ-зависимых генов происходят уже в первые часы действия низкой температуры и кадмия. Совместное действие стресс-факторов приводит к изменению уровня экспрессии этих генов в более поздний период.

Таким образом, гены АТФ-зависимых протеиназ принимают непосредственное участие в защитных реакциях растений пшеницы на действие абиотических факторов среды разной природы.

Список литературы

1.Голизаде А., Фаизи М. Х., Конероуз Б. Б., Капур Х. С. Молекулярное клонирование гена ClpS актинобактериального типа из библиотеки кДНК Celosiacristata // Физиология растений, 2008. Т. 55. № 4. С. 579–587.

2.Локшина Л. А., Соловьева Н. И., Орехович В. Н. Роль лизосомальных протеиназ в деструкции ткани // Вопр. мед. химии, 1987. Т. 33. № 5. С. 38–43.

3.Лысенко Л. А., Немова Н. Н., Канцерова Н. П. Протеолитическая

регуляция биологических процессов. Петрозаводск, 2011. 482 с.

4.Немова Н. Н., Бондарева Л. А. Протеолитические ферменты: учебное пособие. Петрозаводск, 2005. 92 с.

5.Domingues F., Cejudo F. J. Patterns of starchy endosperm acidifica-

tion and protease gene expression in wheat grains following germination // Plant Physiol. 1999. Vol. 119. № 1. P. 81–87.

388