Вопросы для самоподготовки

1. Строение простых и сложных белков.

Коферментные формы витаминов В₁(ТДФ), В₂ (ФМН и ФАД), РР (НАД⁺и НАДФ⁺), В₆(ПФ).

Биологическая роль ферментов. Понятие энергетического барьера реакции и энергии активации.

Этапы ферментативного катализа.

Характеристика структурно-функциональной организации ферментов по плану:

• простые ферменты;

• сложные ферменты: понятие холофермента, апофермента, кофактора, кофермента, простетической группы;

• активный центр (контактный и каталитический участки);

• аллостерический центр.

Кислотно-основной и ковалентный механизмы катализа.

Сходство и различие в действии ферментов и неорганических катализаторов.

Общие принципы количественного определения активности ферментов. Единицы активности ферментов.

Мультиферментный комплекс, строение, принципы самосборки, роль. Примеры.

Изоферменты, особенности их строения на примере лактатдегидрогеназы и креатинкиназы.

Основные свойства ферментов. Графики зависимости скорости ферментативной реакции:

• от температуры;

• от pH среды;

• от концентрации субстрата;

• от концентрации фермента.

Специфичность, виды специфичности. Механизмы специфичности – теория Фишера и теория Кошланда.

Способы регуляции скорости ферментативных реакций в клетке (in vivo):

• компартментализация;

• изменение количества фермента – на примере влияния глюкокортикоидов на глюконеогенез;

• изменение доступности субстрата на примере оксалоацетата и цикла трикарбоновых кислот;

• проферменты и их ограниченный протеолиз на примере ферментов желудочно-кишечного тракта;

• белок-белковое взаимодействие на примере активации аденилатциклазы (присоединение регуляторных белков) и на примере протеинкиназы А (диссоциация белка на протомеры). Схемы процессов;

• аллостерические механизмы регуляции ферментов: а) схема изменения активности фермента при воздействии эффектора, б) роль аллостерической регуляции метаболизма на примере фосфофруктокиназы;

• ковалентная модификация ферментов на примере ферментов гликогенсинтазы и гликогенфосфорилазы. Схема механизма регуляции.

Характеристика ингибирования ферментов. Конкурентное и неконкурентное ингибирование. Обратимое и необратимое ингибирование. Примеры.

Исследование восстановления пероксида водорода ферментом каталазой. Принцип метода.

Исследование специфичности действия ферментов на примере амилазы и уреазы. Принцип метода.

Влияние активаторов и инактиваторов ферментов на скорость реакции на примере амилазы. Принцип метода.

Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры на примере амилазы слюны и дегидрогеназ дрожжей. Принцип методов.

Темы для реферативных сообщений

1. Роль эссенциальных микроэлементов в функционировании и регуляции активности ферментов.

Лабораторная работа 1

Оценка скорости реакции спонтанного и ферментативного восстановления пероксида водорода

Реактивы

3% р-р H₂O₂.

Материал исследования

Свежая кровь животных – источник фермента каталазы.

Принцип

Каталаза (КФ 1.11.1.6.) ускоряет реакцию восстановления пероксида водорода:

2H₂O₂ 2Н₂О + О₂

В этой реакции одна молекула пероксида водорода окисляется и служит донором электронов, а другая восстанавливается и является акцептором электронов. Образуемый кислород выделяется в виде пузырьков.

Проведение анализа

В 2 пробирки вносят по 10 капель пероксида водорода. В одну из пробирок добавляют 1 каплю крови. Активность фермента выявляется по появлению пузырьков кислорода.

Оформление работы

Отмечают принцип метода, ход работы, сравнивают полученные результаты и объясняют их.

Лабораторная работа 2

Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры

Исследование влияния температуры на активность амилазы слюны

Реактивы

1) 1% р-р крахмала, 2) р-р Люголя.

Материал исследования

Слюна, разведенная 1:10 (источник ‑амилазы).

Принцип

Для исследования зависимости скорости ферментативной реакции от температуры в работе используется гидролиз крахмала амилазой (диастаза, 1,4‑‑D‑глюкангидролаза, КФ 3.2.1.1.) слюны. При инкубации смеси субстрата (крахмал) и фермента (амилаза слюны) в разных температурных условиях фермент будет гидролизовать неодинаковое количество субстрата.

Гидролиз крахмала под действием амилазы проходит через стадии образования декстринов до дисахарида мальтозы.

Крахмал + Н₂ОМальтоза + Декстрины

Количество расщепленного крахмала оценивают по цветной реакции с йодом. Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание. Продукты гидролиза крахмала (декстрины) в зависимости от размера молекул дают с йодом окрашивание: ● амилодекстрины – фиолетовое, ● эритродекстрины – красно-бурое, ● ахродекстрины и мальтоза – цветная реакция отсутствует, желтый цвет соответствует цвету водного раствора йода.