Раздел 1. Строение, свойства и функции белков

Тема 1.1. Строение и классификация аминокислот. Структура белков

Актуальность

Аминокислоты являются материалом для строительства белков – пластического материала клеток живого организма. Особенностями аминокислотного состава обусловлено огромное разнообразие структуры и функций белковых молекул, благодаря чему белкам принадлежит ведущая роль во всех процессах жизнедеятельности. Аминокислоты участвуют в образовании биогенных аминов, азотистых оснований и мононуклеотидов, нейромедиаторов и т.д. Ряд из них используются в качестве лекарств.

Цель

Знакомство со строением, физико-химическими свойствами и классификацией аминокислот, входящих в состав белков организма человека.

Приобретение практических навыков по проведению качественного анализа биологических жидкостей на присутствие аминокислот, пептидов и белков при помощи цветных реакций.

Вопросы для самоподготовки

Принципы классификации аминокислот.

Классы аминокислот:

• по биологической роли (заменимые и незаменимые);

• по физико-химическим свойствам (нейтральные, кислые, основные; гидрофобные, гидрофильные);

• по химическому строению (с алифатическими радикалами, с дополнительной функциональной группой, с ароматическим и гетероциклическим радикалом, иминокислоты);

• по растворимости в воде (неполярные, полярные незаряженные, полярные отрицательно и положительно заряженные).

Структурные формулы протеиногенных аминокислот.

Физико-химические свойства аминокислот, роль их функциональных групп.

Изоэлектрическая точка аминокислот и пептидов. От чего она зависит?

Влияние изменения рН на заряд аминокислот.

Пептидная связь, реакция образования. Свойства пептидной связи.

Влияние изменения рН на заряд и растворимость пептидов.

Цветные качественные реакции на аминокислоты и белки. Принцип методов. Практическое применение реакций.

Обнаружение белка и свободных аминокислот в биологическом материале. Ключевые моменты анализа. Как удалить белок из биологической жидкости? Как обнаружить наличие свободных аминокислот в жидкости?

Лабораторная работа 1

Цветные качественные реакции на белок и аминокислоты

Реактивы

1) 1% р-р яичного белка, 2) 0,5% р-р нингидрина, 3) 30% р-р NaOH, 4) 10% р-р NaOH, 5) 5% р-р Pb(CH₃COO)₂, 6) 5% р-р нитропруссида натрия, 7) конц.HNO₃, 8) 5% р-рCuSO₄.

Материал исследования

При изучении цветных реакций в качестве объекта исследования используют 1% водный раствор яичного белка, содержащего полный набор аминокислот.

Реакция на пептидную связь

Для обнаружения пептидной связи в белках и пептидах используется универсальная биуретоваяреакция. Биуретовую реакцию дают вещества, содержащие не менее двух пептидных группировок.

Принцип

Пептидная группа образует в щелочной среде с ионами Сu²⁺комплексное соединение фиолетового цвета с красным или синим оттенком в зависимости от числа пептидных связей. Интенсивность окрашивания пропор­циональна количеству пептидных групп.

Проведение анализа

В пробирку с 5 каплями 1% раствора белка вносят 3 капли 10% раствора NаОН и 1 каплю 5% раствора CuSО₄.

Реакция для обнаружения ‑аминогрупп

Для обнаружения ‑аминогрупп, содержащихся в аминокислотах, и концевых‑аминогрупп пептидов и белков используетсянингидриновая реакция.

Принцип

При нагревании аминокислот и пептидов с нингидрином происходят окислительное отщепление ‑аминогрупп и восстановление нингидрина. Восстановленный нингидрин реагирует с аммиаком и другой молекулой окисленного нингидрина с образованием комплекса сине-фиолетового цвета.

Проведение анализа

5 капель раствора белка смешивают с 5 каплями 0,5% раствора нингидрина. Пробирки нагревают и кипятят до появления сине-фиолетового окрашивания.

Реакция на ароматические аминокислоты

Для обнаружения ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин, триптофан) используется ксантопротеиновая реакция.

Принцип

Ароматическое кольцо при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой образует динитросоединение желтого цвета.

Проведение анализа

К 5 каплям 1% раствора белка добавляют 2 капли конц.HNO₃и осторожно нагревают. Наблюдают за появлением желтого окрашивания, при отсутствии желтого цвета еще добавляют 1-2 капли конц.HNO₃. При добавлении избытка 30% раствора NаОН окраска переходит в оранжевую.

Реакции на серосодержащие аминокислоты

Принцип

Сульфгидрильные группы в белке или пептиде подвергаются щелочному гидролизу, в результате чего происходит отщепление серы в виде сульфида натрия Na₂S, который вступает в дальнейшие реакции:

• реакция Фоля– Na₂S с ацетатом свинцаPb(CH₃COO)₂дает черный или бурый осадок сульфида свинца;

• реакция с нитропруссидом– Na₂S дает с нитропруссидом натрия соединение, окрашенное в красно-коричневый цвет.

Проведение анализа

5 капель 1% раствора белка и 5 капель 30% раствора NaOH кипятить 1‑2 минуты. Разделить содержимое на 2 части для реакций "а" и "б".

а) Реакция Фоля

К 5 каплям гидролизата добавляют 1 каплю раствора уксусно-кислого свинца и нагревают до кипения. Отмечают появление бурого или черного осадка.

б) Реакция с нитропруссидом

К 5 каплям гидролизата добавляют 2-3 капли раствора 5% натрия нитропруссида. Отмечают появление красно-коричневого окрашивания.

Практическое значение цветных реакций

Цветные реакции, являясь универсальными (биуретовая, нингидриновая) и специфическими (реакция Фоля, ксантопротеиновая), позволяют установить белковую природу вещества, обнаружить белок и аминокислоты в растворе, изучить состав белков и пептидов.

Принцип этих реакций используется для количественного определения аминокислот и белков в биологических жидкостях.

Оформление работы

Результаты оформляют в виде таблицы, где отмечают полученный цвет раствора и интенсивность окраски. Интенсивность окраски обозначают следующим образом: ‘’–‘’ отсутствие окраски; ‘’+’’ слабая окраска; ‘’++’’ сильная окраска; ‘’+++’’ очень сильная окраска.

Объект исследования	Реакции
	Биурето­вая	Нингид­риновая	Ксантопро­теиновая	Фоля	С нитро­пруссидом
Раствор яичного белка

В выводах указывается на возможность обнаружения пептидных связей и некоторых типов аминокислот при помощи используемых реакций.