Проведение реакции.

Приготовление препарата слюны (выполняет дежурный для всей группы).

Собирают 1 мл слюны в мерную пробирку и доводят дистиллированной водой до метки 10 мл, хорошо перемешивают (не встряхивая!).

Чтобы исключить ферментативную реакцию до достижения необходимой температуры, растворы слюны и крахмала сначала прогревают по отдельности.

1. В 4 пробирки (1, 2, 3, 4) вносят по 10 капель крахмала. Флакон с раствором крахмала предварительно взболтать! В следующие 4 пробирки (5, 6, 7, 8) вносят по 10 капель разведенной слюны (раствор ‑амилазы). Пробирки делят по парам – 1-5, 2-6, 3‑7, 4‑8.

2. 1-ю пару пробирок помещают в баню со льдом (0°С). 2-ю пару оставляют при комнатной температуре (20°С). 3-ю пару выдерживают при температуре 38-40°С. 4-ю пару пробирок помещают в кипящую водяную баню (100°С).

3. Через 3 минуты содержимое каждой пары пробирок объединяют, перемешивают и немедленно помещают на 10 минут в те же условия.

4. Проверяют ход реакции. Для этого из 3-й пробирки (38-40°С) отбирают на предметное стекло 3 капли смеси и добавляют 1 каплю реактива Люголя:

• если окраска синяя, то это указывает на низкую скорость гидролиза крахмала. В этом случае необходимо продлить время инкубации.

• появление красного или желтого окрашивания указывает на завершение гидролиза крахмала амилазой (можно переходить к п.6).

6. По завершении гидролиза крахмала в 3-й пробе во все пробирки одновременно добавляют по 2 капли реактива Люголя и сравнивают цвет раствора в пробах.

Оформление работы

Отмечают принцип метода, ход работы. Результаты работы оформляют в виде таблицы. В выводах отмечают оптимальную температуру действия фермента.

N пробы	Температура инкубации	Окраска	Относительная скорость реакции
1 2 3 4	0°С 20°С 38°С 100°С

Исследование влияния температуры на активность дегидрогеназ дрожжей

Реактивы

1) 10% р-р глюкозы, 2) 0,01% р-р метиленового синего.

Материал исследования

Суспензия пекарских дрожжей.

Принцип

При окислении глюкозы анаэробные дегидрогеназы дрожжей катализируют реакции переноса атомов водорода от продуктов окисления на промежуточный акцептор (восстановление акцептора). Обнаружение активности дегидрогеназ проводится по изменению окраски добавленного к суспензии дрожжей метиленового синего (акцептора), который при восстановлении обесцвечивается.

Проведение анализа

	Опыт 1, капли	Опыт 2, капли
Суспензия дрожжей	10	10
	Выдерживают при 100°С в течение 10 минут	––
10% р-р глюкозы	10	10
0,01% р-р метиленового синего	1	1
	Пробирки закрывают пробками и помещают на 10 минут в водяную баню при 38С. Наблюдают за изменением окраски в пробирках.

Оформление работы

Отмечают принцип метода и ход работы. Результаты работы оформляют в виде таблицы. В выводах отмечают причину изменения скорости реакции.

Пробы	Окраска	Относительная скорость реакции
Опыт 1 Опыт 2

Лабораторная работа 3

Исследование специфичности действия ферментов

Реактивы

1) 1% р-р мочевины, 2) 1% р-р тиомочевины, 3) 0,5% спиртовый р-р фенолфталеина, 4) 1% р-р крахмала, 5) 1% р-р сахарозы, 6) реактивы Фелинга: Фелинг I и Фелинг II.

Материал исследования

Приготовленный из семечек арбуза препарат уреазы.

Слюна, разведение 1:10 (источник ‑амилазы).

Обнаружение абсолютной специфичности действия фермента уреазы

Принцип

Метод основан на сравнении возможности гидролиза уреазой (КФ 3.5.1.5.), сходных по строению субстратов – мочевины и тиомочевины.

Действие фермента обнаруживается по изменению окраски индикатора фенолфталеина в щелочной среде, которая создается при выделении аммиака при гидролизе мочевины ферментом уреазой.

Мочевина + Н₂О2NH₃+ CO₂

Проведение реакции

Приготовление препарата уреазы:

Очистить 3-4 семечка арбуза, зерна растереть в ступке в 1 мл дистиллированной воды, затем довести объем до 10 мл. Полученную эмульсию фильтруют и используют как препарат фермента уреазы.

	Опыт 1, капли	Опыт 2, капли
1% р-р мочевины 1 % р-р тиомочевины Препарат уреазы Р-р фенолфталеина	10 –– 10 1-2	–– 10 10 1-2
	Перемешивают. Выдерживают 3-5 минут. Наблюдают за появлением розовой окраски в одной из пробирок.