Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

210 Экспрессия генетического материала

Рис. 16.2. Мутагенез in vitro используется для выявления 5'-фланкирующих последовательностей, участвующих в контроле транскрипции. На стадии 1 рестрикционный фрагмент ДНК, содержащий ген tk, подвергают расщеплению с обоих концов экзонуклеазой III и нуклеазой SI. Образующиеся продукты расщепления для большей наглядности изображены здесь в виде двух наборов дискретных 5'и 3'-концевых фрагментов. В действительности, индивидуальные фрагменты как таковые идентифицируют только после клонирования и определения нуклеотидной последовательности, как показано на схеме (стадии 2 и 3). На стадии 2 к концам каждого из фрагментов в смеси присоединяют Ват HIлинкеры и проводят встраивание в вектор pBR322 по Ваm HI-сайту. После этого индивидуальные фрагменты могут быть получены с помощью клонирования рекомбинантных плазмид в Е. coli, как обсуждалось в гл. 9 (стадия 3).

и образует нуклеосому, имитирующую естественный субстрат для транскрипции в ядре.

Хорошим примером применения такого подхода является мутационное картирование регуляторных последовательностей, необходимых для транскрипции гена тимидинкиназы (tk) вируса герпеса. Этот ген может

Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

Рис. 16.3. Мутантные гены tk, полученные, как показано на рис. 16.2. Нормальная последовательность соответствующей области гена tk приведена в верхней строке (показана только последовательность некодирующей цепи). Встраивание в эту последовательность Ваm HI-линкера на различных участках приводит к возникновению нуклеотидных замен, выделенных цветом. Эффективность транскрипции для каждого из мутантных генов указана в табл. 16.2 (По McKnightS.L, Kingsbwy R., 1982. Science 217, 316.)

Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

212 Экспрессия генетического материала

экспрессироваться во многих типах эукариотических клеток, о чем свидетельствует инфекционная активность вируса по отношению к широкому спектру эукариотических организмов, а также способность воспроизводиться в соматических клетках многих типов тканей. Во всех случаях на 5'-конце РНК-транскрипта гена tk обнаруживается одна и та же последовательность, что указывает на способность промотора tk функционировать идентично в разных типах эукариотических клеток.

Для идентификации в 5'-фланкирующей последовательности нуклеотидов, вовлеченных в регуляцию транскрипции гена tk, можно было бы вводить мутации в каждое положение. Такой подход оказался бы чрезвычайно трудоемким. Более эффективный метод, названный линкерным сканированием, был использован в работе Мак-Найта и его коллег. Этот метод (рис. 16.2) включает создание в клонированном гене tk двух наборов делеций - с левого и с правого конца клонированной последовательности. Протяженность делеции в каждом делеционном варианте фиксировали с помощью определения нуклеотидной последовательности. Были получены 43 различные делеции с 5'-конца и 42 - с 3'-конца, вошедшие в состав мутагенизированных таким образом генов tk (рис. 16.2). С использованием подходящих делеционных мутантов из каждого набора можно было сконструировать гены, содержащие мутации замещения и отличающиеся от нормальной последовательности tk в десяти или менее положениях нуклеотидных пар. Некоторые из этих мутантных последовательностей показаны на рис. 16.3.

В каждом случае влияние замещения определенных участков последовательности на эффективность транскрипции определяли, инъецируя очередную конструкцию, состоящую из клонирующего вектора pBR322 со встроенным мутантным геном tk, в ядра ооцитов Xenopus. После 24 часов инкубации из ооцитов экстрагировали суммарную РНК и определяли в ней содержание и структуру транскрипта гена tk. Результаты, представленные в табл. 16.2, позволяют выявить три участка в 5'-фланкирующей последовательности, необходимые для эффективной транскрипции гена tk (отмечены на рис. 16.4). Более того, оказалось, что участок, расположенный ближе других к точке инициации и содержащий

Таблица 16.2. Эффективность транскрипции мутантных генов tk, показанных на рис. 16.3, в ооцитах Xenopus
Мутант	Эффективность экспрессии	Мутант	Эффективность экспрессии
LS-119/-109 LS-115/-105 LS-111/-101 LS-105/-95 LS-95/-85 LS-84/-74 LS-80/-70 LS-79/-69 LS-70/-61	1,20 1,36 0,04 0,03 0,12 0,09 0,87 0,70 0,94	LS-59/-49 LS— 56/— 46 LS— 47/— 37 LS— 42/— 32 LS— 29/- 18 LS-21/-12 LS-16/-6 LS-7/+3 LS + 5/ + 15	0,08 0,11 1,27 0,68 0,06* 0,07 0,96 1,04* 1,18*
* Транскрипция начинается в точке, отличной от нормальной точки инициации транскрипции.
По McKnightS.L., Kingsbury R., 1982. Science, 217, 316.