Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
современная генетика т2.doc
Скачиваний:
190
Добавлен:
21.02.2016
Размер:
9.54 Mб
Скачать

Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

308 Экспрессия генетического материала

мами (ПГОХ). Расстояние в одну единицу соответствует частоте котрансформации в 99%. Тогда в этих единицах расстояние между генами ТК1 и COLM равно 100 - 74 = 26, а между ТК1 и GALK-100-19 = 81. Сами по себе эти цифры ничего не говорят о взаимном расположении исследуемых генов, но данные о том, что ТК1 иногда котрансформируется с GALK, не захватывая COLM, указывают на то, что порядок этих генов следующий: GALK-TK1-COLM.

Картирование генов с помощью днк-зондов

Методы картирования генов, обсуждавшиеся в предыдущих разделах, были основаны на экспрессии изучаемых генов в культурах клеток. Гены, кодирующие ферменты клеточного метаболизма, (табл. 18.2) и гены, кодирующие поверхностные антигены, такие, как белки главного комплекса гистосовместимости или антигены группы крови, удовлетворяют этому условию. Гены, не обладающие подобным фенотипическим проявлением, не могут быть картированы лишь с использованием описанных методов. Это ограничение удается преодолеть с помощью методов генной инженерии. При этом становится возможным картирование любых последовательностей ДНК, для которых можно получить соответствующий ДНК-зонд. Эти методы внесли поистине революционный переворот в генетический анализ гибридов соматических клеток.

Первое применение методов работы с рекомбинантными ДНК для картирования генов человека включало ДНК-гибридизацию в растворе. Таким образом, удалось картировать гены α- и ß-глобинов. Зонды, представляющие собой комплементарные ДНК (кДНК) этих генов, были получены с помощью обратной транскрипции очищенных α- и ß-глобиновых мРНК. Эти зонды в определенных условиях не взаимодействуют друг с другом или с глобиновыми генами мыши, но образуют стабильные дуплексы при отжиге с соответствующими последовательностями ДНК человека. Глобиновые кДНК-зонды использовали для тестирования в растворе препаратов ДНК, выделенных из различных гибридных клонов. Образование стабильного дуплекса между кДНКзондом и ДНК исследуемого препарата свидетельствовало о присутствии человеческих глобиновых генов в геноме соответствующей гибридной линии. Кариологический анализ выявленных таким образом гибридных клонов позволил заключить, что гены ß-глобинового семейства расположены в хромосоме 11, а α-глобиновые гены - в хромосоме 16.

Для проведения гибридизационного анализа в растворе требуется большое количество ДНК. Дополнительные затруднения связаны также с возможностью перекрестной гибридизации между гомологичными генами человека и мыши. Многие из этих трудностей могут быть преодолены с помощью блот-гибридизации по Саузерну. На первом этапе соответствующий ДНК-зонд метят радиоактивными изотопами (такими, как 32Р или 3Н) с помощью ник-трансляции. Затем из гибридных линий клеток, несущих определенные хромосомы человека, выделяют препараты тотальной ДНК. Как показано на рис. 18.17, эти препараты ДНК

Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

18. Генетика соматических клеток: картирование генома 309

Таблица 18.2. Ферментные маркеры, используемые для определения групп сцепления генов человека при работах с культурами клеток

Хромосома

Плечо

Фермент (символ гена)

1

P

Енолаза 1(ENO1)

P

Фосфоглюкомутаза-1 (PGM1)

q

Пептидаза-С (PEPС)

q

Фумаратгидратаза (FH)

2

p

Малатдегидрогеназа-1 (MDH1)

q

Изоцитратдегидрогеназа-1 (IDH1)

3

P

Аминоацилаза-1 (ACY1)

4

?

Пептидаза (PEPS)

P?

Фосфоглюкомутаза-2 (PGM2)

5

q

ß-гексозаминидаза-В (НЕХВ)

6

P

Глиоксалаза 1 (GLO)

q

Супероксидцисмутаза-2 (SOD2)

q

Малатдегидрогеназа-1 (МЕ1)

7

q

ß-глюкуронидаза (GUSB)

8

p

Глутатионредуктаза (GSR)

9

P

Аконитаза-1 (АС01)

q

Аденилаткиназа-1 (АК1)

10

q

Глутамат-оксалоацетат — трансаминаза- 1 (GO T1 )

11

p

Лактатдегидрогеназа-А (LDHA)

12

p

Триозофосфатизомераза-1 (TRI1)

q

Пептидаза-В (РЕРВ)

13

q

Эстераза-D (ESD)

14

q

Нуклеотидфосфорилаза (ΝΡ)

15

q

Маннозофосфатизомераза (MPI)

q

Пируваткиназа-М2 КМ2)

16

q

Аденозинфосфорибозилтрансфераза (APR Т)

17

q

Галактокиназа (GALK)

18

q

Пептидаза-А (PEP А)

19

?

Глюкозофосфат-изомераза (GPI)

?

Пептидаза (PEPD)

20

q

Аденозиндезаминаза (ADA)

21

q

Супероксиддисмутаза (SOD1)

22

q

Аконитаза-2 (АСО2)

X

q

Глюкозо-фосфатдегидрогеназа (GGPD)

q

Фосфоглицерокиназа (PGK)

По Shous T. В.

(1982). Adv

. Human Genetics, 12, 341-452.

обрабатывают рестрицирующими эндонуклеазами, а полученные фрагменты ДНК разделяют гель-электрофорезом, денатурируют и переносят на нитроцеллюлозные мембранные фильтры. На фильтрах осуществляется гибридизация с тем или иным меченым ДНК-зондом. Для большей эффективности можно разделять амплифицированные фрагменты хромосомной ДНК. Для этого используют их предварительное клонирование на фаговых векторах.

После гибридизации фильтры накладывают на рентгеновскую пленку, на которой после проявления обнаруживаются полосы, соответ-