Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

58 Экспрессия генетического материала

Рис. 11.19. А. Рестрикционная карта участка плазмиды pOV 230, содержащего овальбуминовую кДНК, и сопоставление с овальбуминовой мРНК. Б. Полученные при расщеплении рестриктазами HindIII и HaeIII фрагменты OVL и OVR могут быть очищены с помощью электрофореза в агарозном геле. Векторная часть плазмидной ДНК (рМВ9) при этом расщепляется на много мелких фрагментов, мигрирующих гораздо быстрее, чем OVL и OVR. После извлечения из агарозного геля фрагменты OVL и OVR могут быть получены в чистом виде. (По LaiE. et al. 1978. Ргос. Nat. Acad. Sei. USA, 75, 2205.)

двух фрагментов, содержащих 1150 и 1450 нуклеотидов (рис. 11.19). Меньший фрагмент содержит кДНК, соответствующую 5'-концевому участку, а больший фрагмент-3'-концевому участку мРНК. С помощью ник-трансляции, используя ДНК-полимеразу I E. coli (см. гл. 13) и ³²Р-дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, в каждый из этих фрагментов можно ввести радиоактивную метку in vitro. Помеченные таким образом до очень высокой удельной активности фрагменты кДНК можно нагреванием перевести в одноцепочечную форму и использовать в качестве зондов для идентификации комплементарных фрагментов, содержащихся в денатурированной суммарной ДНК куриного генома.

Поскольку кДНК, полученная по овальбуминовой мРНК, не содержит Eco Ri-сайтов, то можно было бы ожидать, что при расщеплении тотальной куриной ДНК рестриктазой Eco RI образуется только один фрагмент ДНК, содержащий последовательность, комплементарную кДНК (в куриной ДНК имеется множество сайтов для Eco RI, так что какие-то два из них наверняка окажутся по каждую сторону овальбуминового гена). Такой фрагмент может быть идентифицирован с помощью гель-электрофоретического разделения по размеру фрагментов куриной геномной ДНК, расщепленной EcoRl, денатурации фрагментов и последующей гибридизации с денатурированным меченым кДНК-зондом (рис. 11.20). Осуществление такого эксперимента дало весьма неожиданные результаты. Оказалось, что не один, а четыре фрагмента различной длины содержат последовательности, комплементарные тому

Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

П. Передача информации в клетках 59

Рис. 11.20. Изображение радиоавтограммы, полученной после расщепления суммарной куриной ДНК рестриктазой EcoRI, электрофоретического разделения в агарозном геле, переноса по Саузерну и гибридиза-	ции с радиоактивными зондами, полученными на основе фрагментов OVL и OVR по отдельности и в смеси. (По Lai E. et al. 1978. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 75, 2205.)

или иному из двух кДНК-зондов (рис. 11.20). Это может означать только то, что в истинный овальбуминовый ген входят участки последовательности, содержащие сайты узнавания для Eco RI, которые не включаются в последовательность мРНК. Эти четыре EcoRI-фрагмента отмечены на карте (рис. 11.17), построенной на основе серии аналогичных экспериментов с использованием набора различных рестриктаз для расщепления и сопоставления куриной геномной ДНК и овальбуминовой кДНК.

До того как было открыто существование интронов, процесс образования цитоплазматических мРНК представлялся достаточно неясным. Биохимические исследования ядерной РНК показали, что в ее состав входят молекулы значительно большего размера, чем молекулы цитоплазматических мРНК. РНК этого типа называется гетерогенной ядерной РНК (гяРНК). Было обнаружено, что большая часть гяРНК не попадает в цитоплазму, а подвергается деградации до нуклеотидов непосредственно в ядре. С помощью биохимических методов не удавалось установить, синтезируются ли в ядре молекулы мРНК в том виде, в котором они обнаруживаются в цитоплазме. Можно было предположить, что в ядре их не удается обнаружить просто из-за большого избытка гяРНК. В то же время представлялось весьма вероятным, что мРНК синтезируется в виде предшественников, входящих в состав гяРНК, а образование зрелых мРНК является результатом нуклеазного процессинга при выходе в цитоплазму. Решение проблемы было найдено благодаря тому, что были обнаружены внутренние некодирующие последовательности, входящие в состав некоторых структурных генов.

Размер транскриптов гена овальбумина, которые содержатся в ядрах клеток яйцевода, удалось определить с использованием высокорадиоактивных кДНК-зондов, полученных по овальбуминовой мРНК так, как