Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
современная генетика т2.doc
Скачиваний:
190
Добавлен:
21.02.2016
Размер:
9.54 Mб
Скачать

Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

56 Экспрессия генетического материала

Рис. 11.18. Последовательность куриной овальбуминовой мРНК. Остатки 13-1872 присутствовали в ДНК плазмиды pOV 230; остатки 1-12 и 1731-1872 были определены непосредственно по последовательности мРНК. Звездочкой помечен овальбуминовый терминаторный кодон. Зрелый овальбумин [в структуре которого отсутствует N-концевой (инициаторный) метионин] имеет сле-

дующий аминокислотный состав: Ala (А) 35, Arg (R) 15, Asn(N)17, Asp (D) 14, Cys(C)6, Gin (Q) 15, GIu(E)33, GIy(G)19, His(H)7, He (I) 25, Leu (L) 32, Lys (К) 20, Met (M) 16, Phe (F)20, Pro (P) 14, Ser(S)38, Thr(T)15, Trp(W)3, Tyr(Y)10, Val(V)31. Всего 385 остатков. (Modified courtesy of J. F. Catterall and B. W. O'Malley, from L Me. Reynolds et ai, Nature 273, 723, 1978.)

Вкратце рассмотрим те методы, которые позволяют получить изображенную на рис. 11.17 картину структурной организации гена. Сначала из полисом клеток куриного яйцевода, в котором овальбумин является основным синтезируемым белком, выделяют овальбуминовую мРНК, которая содержится там в значительном количестве копий. Эта

Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

11. Передача информации в клетках 57

Таблица 11.1. Известные сайты узнавания для рестриктаз в последовательности плазмиды pOV230, несущей встроенную овальбуминовую кДНК (остатки 13-1872 на рис. 11.18)

Фермент1)

Номера остатков2)

Узнаваемые последовательности

1) Отсутствуют сайты узнавания для рестриктаз HaeII, HindII, HindIII, HhaI, HpaII, EcoRI, AvaI, BamI, BalI, BglII, SmaI, XhoI и SalI.

21 Приведены номера, соответствующие положению первого (5'-) нуклеотида в узнаваемой последовательности, а не точке расщепления. Для случаев, когда расщепление происходит внутри узнаваемой последовательности, положение соответствующей точки помечено косой чертой. (По Me Reynolds L. et. al. 1978. Nature, 273, 723.)

мРНК состоит из 1872 нуклеотидов, что значительно больше, чем необходимо для кодирования аминокислотной последовательности овальбумина. Овальбуминовая мРНК содержит транслируемый участок из 1158 нуклеотидов, заключенный между нетранслируемыми фланкирующими 5'- и 3'-участками, а также некодирующий «хвост» poly А на 3'-конце. Двухспиральная ДНК-копия (кДНК) молекулы мРНК синтезируется in vitro с помощью обратной транскриптазы и после встраивания в подходящий плазмидный вектор клонируется в E. coli. Полученная таким образом рекомбинантная плазмида pOV230 содержала в качестве вставки к ДНК, соответствующую остаткам 13-1872 исходной мРНК. Была определена нуклеотидная последовательность кДНКфрагмента гибридной плазмиды и составлена карта расположения на ней сайтов узнавания ферментами рестрикции. Соответствующая последовательность мРНК, выведенная из последовательности кДНК, показана на рис. 11.18, а список сайтов расщепления кДНК рестриктазами приведен в таблице 11.1. Здесь существенно отметить, что в овальбуминовой кДНК отсутствуют сайты узнавания для рестриктаз Eco RI и HindIII и имеется один сайт расщепления НаеIII по остатку 818. После расщепления очищенной плазмиды pOV230 рестриктазами HindIII и НаеIII кДНК можно отделить от плазмидной ДНК в виде