Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
современная генетика т2.doc
Скачиваний:
190
Добавлен:
21.02.2016
Размер:
9.54 Mб
Скачать

Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

14. Рекомбинация 153

Интеграция и эксцизия профагаλ

Процессы интеграции и эксцизии профага λ являют собой наиболее изученные примеры сайт-специфической рекомбинации. Интеграция направляется белком интегразой, продуктом фагового гена int, при участии клеточного белка, роль которого в этом процессе до конца не изучена (см. рис. 7.8). При рекомбинации между фаговым attP-сайтом POP' и хозяйским хромосомным αttΒ-сайтом ВОВ' образуются два рекомбинантных сайта ВОР' и РОВ' слева и справа от встроенной ДНК профага. Индуцируемая эксцизия (вырезание) профага осуществляется посредством рекомбинации между сайтами РОВ' и ВОР' с восстановлением исходных сайтов POP' и ВОВ'. Процесс эксцизии не является простым обращением интегративной рекомбинации. Он затрагивает иные ДНК-субстраты и протекает при участии как интегразы, так и другого фагового белка (эксцизионазы), продукта гена xis.

В фаговом геноме сайт POP' и гены int и xis примыкают друг к другу, образуя своего рода обособленную функциональную единицу, ответственную за сайт-специфическую рекомбинацию. Транскрипция генов int и xis находится под контролем двух различных промоторов. Один из них расположен вне вышеупомянутой структурно-функциональной единицы, что обеспечивает согласование инициации рекомбинационных процессов с определенными этапами в жизненном цикле фага. На начальной стадии инфекции фагом λ транскрипция гена int активируется регуляторным белком cil. При его участии РНК-полимераза может считывать int с промотора р/, локализованного внутри гена xis. Благодаря этому экспрессируется только ген int и образуется интеграза, обеспечивающая встраивание инфицирующего фага в сайт ВОВ' на хромосоме клетки-хозяина (рис. 14.13). С другой стороны, когда в лизогенной

Рис. 14.13. Транскрипция области int-xis генома фага λ контролируется двумя различными промоторами. При лизогенизации образуется только интеграза, необходимая для встраивания фаговой ДНК в хромосому E. coli. При этом белок с cII активирует транскрипцию гена int с

промотора р7, расположенного внутри гена xis. В ходе индукции профага транскрипция обоих генов int и xis инициируется с промотора pL. Синтезируются одновременно и интеграза, и эксцизионаза, необходимые для вырезания фага из хромосомы.

Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

154 Экспрессия генетического материала

клетке происходит индукция профага, транскрипция генов int и xis происходит с общего промотора pL. Нарабатываются белки, продукты генов int и xis, которые направляют рекомбинационную эксцизию профага из хозяйской хромосомы. (Вся совокупность этих и других явлений, составляющих основу жизненного цикла фага λ, будет специально разобрана в гл. 15.)

Пониманию деталей молекулярного механизма int-зависимой рекомбинации способствовало изучение этого процесса in vitro, a также установление первичной структуры участков POP' и ВОВ' и рекомбинантных участков ВОР' и РОВ'. Все эти участки характеризуются наличием общего центрального фрагмента (кора, от англ, core-сердцевина) протяженностью 15 п.н., на котором и разыгрываются основные рекомбинационные события (рис. 14.14).

Каждое из плеч (P, P', В и В') характеризуется особой, отличной от других плеч нуклеотидной последовательностью. Функциональное значение этих участков последовательности исследовали в рекомбинационной системе in vitro, содержащей очищенную интегразу и необходимые клеточные белки. В этой системе можно наблюдать рекомбинацию участков POP' и ВОВ', встроенных в сверхскрученную ДНК плазмиды pBR322, с помощью методов, обсуждавшихся в гл. 9. С использованием клонированных фрагментов, содержащих делеции разной величины в том или ином из плеч P, P', В и В', удается определить необходимый для рекомбинации минимальный размер функциональных участков, окружающих общую кор-последовательность. Было установлено, что функциональный участок POP' содержит по 240 п. н. с каждой стороны от кора. В то же время функционально необходимый участок ВОВ' по размеру не намного превышает саму 15-нуклеотидную кор-последовательность. Участки нуклеотидной последовательности, с которыми специфически связывается интеграза фага λ, были идентифицированы с помощью так называемого «футпринтинга» (от англ, footprint - след ноги ; см. Дополнение 14.2). В связывании участвуют центральная область POP' протяженностью 34 п. н., включающая кор, а также два участка последовательности в плече Ρ и один, более протяженный, в плече Р'. С другой стороны, единственный участок узнавания на хромосоме представляет собой последовательность из 20 п. н., включающую область кора ВОВ'. Вследствие различий в структуре плечевых участков фагового и хозяйского αtt-сайтов рекомбинантные сайты РОВ' и ВОР' в функциональном отношении отличаются от POP' и ВОВ'. Это отличие несомненно и проявляется в том, что интеграза, направляющая процесс встраивания профага, сама по себе оказывается неспособной катализировать обратную реакцию, для осуществления которой необходимо участие дополнительного белка-продукта гена xis.

Механизмы встраивания и вырезания профага пока в точности не известны. Установлено, что очищенная интеграза обладает топоизомеразной активностью. Она делает одноцепочечный разрыв в суперскрученной ДНК, благодаря чему осуществляются свободное вращение и удаление супервитков. Вслед за этим интеграза направляет замыкание фосфодиэфирной связи без использования каких-либо дополнительных источников энергии. Считают, что энергия первоначально расщепленное связи сохраняется благодаря ковалентному связыванию высвободившейся 5'-фосфатной группы с самой интегразой. Известно, что при рекомбинации между POP' и ВОВ' образуется очень короткий участок ге-