Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

314 Экспрессия генетического материала

Рис. 18.19. Распределение метки среди хромосом человека после гибридизации in situ метафазных хромосом с клонированным фрагментом ДНК величиной 14,9 т. п. п., меченным тритием. Большая часть метки связывается с концевой областью короткого плеча хромосомы 1. (По Harper M. E., Sauders G. F., 1981 Chromosoma, 83, 431-439.)

способ картирования генов заключается в непосредственной гибридизации между радиоактивными зондами и метафазными хромосомами. Этот метод гибридизации in situ был разработан для дрозофилы, большие политенные хромосомы которой, несущие много копий каждого гена, значительно облегчали этот процесс. С середины семидесятых годов методы гибридизации in situ были распространены на геном человека. Первоначально этот метод использовали для картирования тандемных повторяющихся последовательностей ДНК, например для генов рибосомной РНК. В последнее время гибридизацию in situ удалось применить и для картирования уникальных генов человека.

Принцип этого метода прост. Рассмотрим его на конкретном примере картирования некоего фрагмента ДНК человека величиной 14,9 т. п. н., клонированного на фаговом векторе. Функция этого фрагмента ДНК не ясна. Известно, что он присутствует в количестве не более одной-двух копий на гаплоидный геном. Метафазные хромосомы человека, распределенные на стандартном предметном стекле, обрабатывали с целью удаления примесей связанной РНК и денатурации хромосомной ДНК. В качестве зонда использовали клонированный фрагмент ДНК, радиоактивно меченный (³Н) с помощью ник-трансляции. Пред-

Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

18. Генетика соматических клеток: картирование генома 315

Таблица 18.5. Результаты гибридизации фрагмента человеческой ДНК (14,9 т.п.н.) с метафазными хромосомами человека
Конкурирующая ДНК (или РНК*)	Концентрация зонда (мкг/мл)	Число исследованных клеток	Клетки в гибридизующейся 1р36	Общее число точек на хромосоме	Число точек на 1р36
Повторяющаяся ДНК	1	21	7(33%)	38	8(21%)
—	1	13	8(62%)	61	8(13%)
тРНК E.coli	5	20	12(60%)	66	18(27%)
Повторяющаяся ДНК	5	17	9(53%)	53	13(25%)
Повторяющаяся ДНК	5	10	7(70%)	31	7(23%)
* Конкурирующая ДНК (или РНК) добавлена в тысячекратном избытке по отношению к зонду. (По Harper M. E., Sounders G. F., 1981. Chromosoma, 83, 431-139.)

метные стекла с метафазными хромосомами инкубировали с зондом в течение 16 часов, затем удаляли избыток меченой ДНК, не связавшейся с денатурированной ДНК метафазных хромосом. Распределение гибридизующихся зон на хромосомах выявляли методом радиоавтографии. Таким образом, в рассматриваемом случае было найдено, что искомая последовательность расположена в теломерной области короткого плеча хромосомы 1, в полосе 1р36 (рис. 18.19).

Часто при гибридизации к меченому зонду добавляют большой избыток (тысячекратный) немеченой конкурирующей ДНК (табл. 18.5). Этот прием уменьшает неспецифическое связывание зонда. В рассматриваемом примере в отсутствие конкурирующей ДНК (второй ряд табл. 18.5) в большей части клеток гибридизация с фрагментом 14,9 т.п.н. происходит в области 1р36, однако значительная часть черных точек на автографе, означающих гибридизацию, оказывается распределена и по многим другим хромосомным локусам. В этом случае могут выявляться последовательности человеческой ДНК, гибридизующиеся с зондом менее специфично. В таблице 18,6 приведены гены человека, картированные с помощью гибридизации in situ.

Таблица 18.6. Гены человека, картированные с помощью гибридизации in situ
Гены	Хромосомы
Легкая цепь иммуноглобулина κ (IGK)
Гистоны (HI, Н2А, Η 2В, НЗ, Н4)
Гомолог c-mos (CMOS)
Гомолог с-тус (СМ УС)
Интерфероны α и β (/FL, IFF)
Инсулин (INS)
γ-Интерферон
Тяжелая цепь иммуноглобулина (IGH)
α-Глобин (НВА)
Коллаген, тип 1, (СОL1АI)
Кластер генов гормона роста (GH)
По Eustachio R. D., Ruddle F. H. (1983). Science, 230, 919-924.