Самостоятельная работа студентов

1. Изучение морфологии вирусов по электронограммам.

2. Освоение методов обработки материалов для вирусологического исследования, взятых от больных (носоглоточные смывы, испражнения и т.д.). Обязательными этапами этой обработки яв­ляются эмульгирование материала в растворе Хэнкса с последующим цен­трифугированием, отсасыванием надосадочной жидкости и добавлением к ней различных антибиотиков (пенициллин, стрептомицин, нистатин) для угнетения сопутствующей микрофлоры.

3. Освоение этапов приготовления первично-трипсинизированной культуры ткани. Изучить этапы приготовления однослойной. трипсинизированной культуры клеток фибробластов человека. Кусочки эмбриональной ткани измельчить ножницами, пропипетировать в растворе Хенкса, поместить в пробирку, профильтровать. К осадку добавить раствор Хэнкса с трипсином. Пере­мешать осевшие дезагрегированные клетки, перенести на предметное стекло, изучить морфологию живых клеток в препарате "раздавленная капля", подсчитать их количество в камере Горяева и внести в пробирку со средой 199 для получения монослоя клеток. Пробирки помещаются в термостат при 37⁰ С на сутки для выращивания.

Изучение клеточных культур производится микроскопическим методом. Для этого пробирка помещается на предметный столик микроскопа; монослой клеток должен быть обращен вверх. Микроскопия проводится с вогнутым зеркалом под малым увеличением микроскопа, конденсор опускается вниз. В пробирке виден сплошной рост одноядерннх клеток в виде одного слоя.

4. Освоение методов культивирования вирусов на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) - заражение РКЭ в амниотическую, аллантоисную полости, на хорион-аллантоисиую оболочку.

Заражение в хорион-аллантоисную полость. Над отмеченным при овоскопии воздушным мешком производят обработку скорлупы спиртом, водой, затем снова спиртом. При закрытом способе заражения в аллантоисную полость в скорлупе над воздушным мешком делают отверстие стерильной иглой. В него вводят иглу шприца, при этом про­калывается хорион-аллантоисная оболочка и игла погружается в аллантоисную полость на I - 2 мм (от поверхности скорлупы расстояние около 1,5 см), после чего вводят 0,2 мл иссле­дуемого материала. Отверстие в скорлупной оболочке закрывают стерильным парафином.

Заражение на хорион-аллантоисную оболочку. После дезинфекции скорлупы последняя отрезается по краю воздушного мешка, дно которого выстлано белой кожистой подскорлупной оболочкой. Ее уда­ляют стерильным пинцетом, соблюдая осторожность, т.к. под ней расположена прозрач­ная, влажная, с развитыми сосудами хорион-аллантоисная оболочка, на которую наносят исследуемый материал. Дефект в скорлупе закрывают стеклянным колпачком или пластинкой, края которых предварительно погру­жаются в расплавленный парафин.

После заражения обоими способами эмбрион маркируют и помещают в термостат.

5. Экспресс-диагностика вирусных инфекций (обнаружение ви­руса или его компонентов в клиническом матери­але, взятом от больного – демонстрация).

• исследование мазков-отпечатков с целью обнаружения внут­риклеточных включений. Микроскопия мазков-отпечатков с поверхности герпетических язв (окраска по Романовскому-Гимза). Обратить внимание на наличие гигантских многоядерных клеток с внутриклеточными включениями.

• исследование мазков-отпечатков со слизистой оболочки верхних дыхательных путей у больного гриппом иммунофлюоресцентным методом. Обратить вни­мание на светящиеся частицы, располагающиеся внутри клеток.

• обнаружение антигенов вируса герпеса в клиническом материале твердофазным иммуноферментным методом.

• молекулярная гибридизация (выявление вирусов, не раз­множающихся в культуре клеток или персистирующих вирусов - цитомегаловирусов, вирусов герпеса, энтеровирусов, ро-тавирусов и т.д.). Реакция основана на гибридизации комплементарных нитей вирусов с формированием двунитчатых структур. Наличие комплементарных нитей выявляют с помощью зондов, которыми яв­ляются ДНК и РНК, меченые ферментом. При добавления субстрата к зонду с ферментом происходит цветная реакция.

Тема 13. ОБЩАЯ ВИРУСОЛОГИЯ: ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ. ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. ИНДИКАЦИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ. СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ.

Методы выявления (индикация) и идентификации вирусов

Перед выявлением вируса в клетках его обычно отделяют от клеток хозяина путем их разрушения с помощью многократного замораживания и оттаивания или растирания со стерильным песком. Полученный вирусосодержащий материал центрифугируют или пропускают через бактериальный фильтр, обрабатывают антибиотиками для деконтаминации и предотвращения бактериального загрязнения.