3. Освоение техники микроскопии с иммерсионным объективом:

• включить освещение, установить освещенность поля зрения, используя объектив х8 и вогнутую поверхность зеркала; поднять конденсор до уровня столика;

• на мазок нанести небольшую каплю иммерсионного масла, поместить препарат на предметный столик;

• вращая револьвер с укрепленными на нем объективами, уста­новить объектив х90, осторожно опустить тубус микроскопа с помощью макрометрического винта вниз под контролем зрения сбоку до погружения фронтальной линзы иммерсионного объектива в каплю масла (почти до сопри­косновения с предметным стеклом). Установить ориентировочный фокус при помощи макрометрического винта, выполняя эту манипуля­цию очень осторожно, чтобы не повредить фронтальную линзу объектива или предметное стекло. Окончательную фокусировку препарата осуществляют микрометрическим винтом, который реко­мендуется вращать не более, чем в пределах одного оборота;

• после окончания работы необходимо тщательно, с помощью специальной тряпочки вытереть масло с иммерсионного объектива, перевести револьвер на малый сухой объектив х8, выключить осве­щение, закрыть микроскоп.

Разрешающая способность иммерсионного микроскопа – 0,2-0,4 мкм.

4. Освоение техники иммерсионной микроскопии (микроскопия демонстрационного препарата Saccharomyces cerevisiae, окраска раствором метиленового синего). В поле зрения микроскопа наблюдаются овальные, круглые, вытянутые синего цвета клетки гриба, расположенные беспорядочно и неправильными скоплениями. Препарат зарисовать.

5. Освоение техники приготовления мазка из агаровой культуры бактерий и окраски его простым способом:

• обезжирить предметное стекло кусочком мыла;

• нанести на поверхность стекла маленькую каплю воды;

• Небольшое количество культуры микроорганизмов, извлеченной из пробирки со скошенным мясо-пептонным агаром (МПА) при помощи стерильной бактериологичес­кой петли, равномерно эмульгируют в капле воды; петлю стерили­зуют прокаливанием, а мазок высушивают на воздухе;

• микропрепарат фиксируют в пламени спиртовки в течение 5-6 сек. Правильно зафиксированный препарат, приложен­ный к тыльной поверхности кисти, вызывает чувство легкого жже­ния. Мазок нельзя ни в коем случае перегревать. Не следует фик­сировать влажный мазок. Несоблюдение указанных требований приводит к искажению морфологических свойств микробов. После фиксации необходимо дать мазку остыть;

• окраска препарата простым способом: на мазок при помощи пипетки наносят 2-3 капли растворов водного фуксина (1-2 мин.), метиленового синего (3-5 мин.) или иного красителя. По окончании окрашивания мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с помощью иммерсионной системы. Препарат зарисовывают.

6. Освоение техники окраски по Граму. На обезжиренное предме­тное стекло наносят на некотором расстоянии друг от друга 2 маленькие капли воды. В одной из них эмульгируют культуру кишечной палоч­ки (Escherichia coli) , в другой – культуру спорообразующей палочки (Bacillus cereus или Staphylococcus aureus). Обе капли во влажном состоянии перемешивают, мазок высушивают, фиксируют и окрашивают по Граму в модификации Синева:

• карболовый генциан-виолет – I - 2 мин. (на полоски фильтровальной бумаги, пропитанные раствором генциан-виолета и высушенные, наносят несколько капель воды);

• краску сливают, не промывая водой, наносят раствор Люголя на I мин. При этом мазок чернеет;

• раствор Люголя сливают, обрабатывают препарат спиртом в те­чение 30 сек, слегка покачивая мазок (до прекращения отхождения лиловых струек);

• немедленно промывают мазок водой;

• докрашивают препарат водным фуксином в течение 1 - 2 мин;

• мазок промывают, высушивают, микроскопируют.

Грамположительные (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus) бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, т.к. образуют и прочно удерживают комплекс генциан-виолета с йодом, не обесцвечивающийся спиртом. Грамотрицательные бактерии (Escherichia coli) окрашиваются в розовый цвет, поскольку неспособны формировать и удерживать комплекс генциан-виолета с йодом, легко обесцвечиваясь спиртом. Препарат зарисовать.

При окраске бактерий по методу Грама необходимо учитывать следующие обстоятельства:

• возраст культуры имеет существенное значение, так как в "старых" культурах тинкториальные свойства бактерий могут быть изменены;

• мазок должен быть тонким и равномерным;

• не рекомендуется подвергать препарат форсированной горячей сушке;

• окрашивать можно лишь полностью остывший препарат.

При окраске мазков, приготовленных из материала от больного для повышения качества препаратов целесообразно промывать мазок после каждого этапа окрашивания.

7. Ознакомление с морфологией и тинкториальными свойствами (отношение к окраске по Граму) различных видов бактерий (микроскопия демонстрационных препаратов). У бактерий выделяют три основные формы: шаровидная, палочковидная (вариант – нитевидная), извитая.

Бактерии шаровидной формы – кокки (coccus –зерно) подразделяются на:

микрококки (отдельно лежащие, как правило, непатогенные);

диплококки (парные кокки – возбудители гонореи, менингококковой инфекции, пневмококк);

стрептококки (цепочки кокков – возбудители гнойных заболеваний и сепсиса, скарлатины, ангин, нефритов и т.д.);

стафилококки (в виде виноградных гроздьев – возбудители гнойных инфекций),

тетракокки (образования из четырех кокков – непатогенные);

сарцины (пакет из 8-16 кокков – непатогенные представители микрофлоры воздуха).

Палочковидная форма бактерий наиболее распространена. Располагаются в виде одиночных клеток, дипло- или стрептобактерий. Края палочковидных бактерий могут быть закруглены, обрублены, утолщены, заострены.

Извитые формы бактерий - вибрионы (изогнутая палочка в виде запятой – холерный вибрион), спириллы ( имеют несколько спиральных завитков), спирохеты (см. ниже).

Промикроскопировать, описать и зарисовать следующие микропрепараты;

1. Стрептококки (Streptococcus pyogenes) - рис. 1. Грамположительные шаровидные микробы, располагающиеся в виде цепочек.

Рис.1. Стрептококки (Streptococcus pyogenes).

2. Стафилококки (Staphylococcus aureus) – рис. 2. Грамположительные шаровидные микробы, располагающиеся в виде гроздьев винограда.

Рис. 2. Стафилококки (Staphylococcus aureus).

3. Кишечная палочка. (Esherichia coli) – рис. 3.. Грамотрицательные палочковидные бактерии с закругленными концами, расположенные беспорядочно.

Рис. 3. Кишечная палочка. (Esherichia coli).

4. Вибрионы холеры (Vibrio cholerae) – рис.4. Грамотрицательные бактерии в виде запятых.

Рис. 4. Вибрионы холеры (Vibrio cholerae).

5. Стрептобациллы (Bacillus cereus) - рис. 5. Окрашиваются по Граму положительно, имеют форму палочек, концы которых обрублены. Образуют цепочки, в теле микробной клетки могут быть видны неокрашенные участки спор. По морфологии напоминают возбудитель сибирской язвы. Препараты описать и зарисовать.

Рис. 5. Стрептобациллы (Bacillus cereus)

По окончании работы пробирки с культурами и демонстрацион­ные мазки сдаются дежурным группы и возвращаются на лаборантский стол. Микроскопы ставят в нерабочее положение и сдают лаборанту кафедры. Воду из тазиков выливают в бак, рабочий стол протирают дезинфицирующим раствором. В конце занятия проводится дезинфекция и мытье рук. Тетрадь с записями и зарисовками, сделанны­ми в ходе занятия, представляется преподавателю на подпись.

8. Знакомство с бактериоскопическим методом диагностики инфекционных болезней. Бактериоскопический метод осно­ван на изучении морфологических и тинкториальных особенностей бактерий в препаратах, приготовленных из материала от больного. Метод широко используется в диагностике чумы, туберкулеза, гонореи, сифилиса и ряда других заболеваний.