Самостоятельная работа студентов

1. Изучить морфологические и тинкториальные свойства возбудителя коклюша (Bordetella pertussis) в демонстра­ционных препаратах из чистой культуры

2. Бактериологический метод. Изучить культуральные свойства возбудителя коклюша культи­вируются на казеиново-угольном агаре КУА или на среде Борде-Жангу (картофельно-глицериновый МПА с кровью) - демонстрация. Колонии Bordetella pertussis мелкие, выпуклые, блестящие в виде капелек ртути. При микроскопии обнаруживают мелкие овоидные грамотрицательные палочки. Изучение ферментативных и антигенных свойств палочки коклюша (демонстрация в соответствии с табл. 17).

3. Серологический метод. Учесть демонстрационные РА и РСК, поставленные с парными сыворотками крови детей (10 и 21 дни болезни) с диагнозом «подозрение на коклюш». Диагностический титр 1:20

4. Биопрепараты для диагностики, профилактики и лечения коклюша:

• АКДС-вакцина (адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина) содержит взвесь убитых коклюшных бактерий, дифтерийный и столбнячный анатоксины, адсорбированные на гидроокиси алюминия. Применяется для активной иммунизации детей против перечисленных инфекций;

• Тетракокк – комбинированная вакцина для профилактики дифтерии, коклюша, столбняка и полиомиелита производства фирмы Пастер Мерье Коннот (Франция).

• агглютинирующие сыворотки - для серологической идентификации коклюшных бактерий;

• иммуноглобулин донорский. Получен из венозной крови человека, содержит антитела против ряда патогенных микроорганизмов (включая бордетеллы), применяется для профилактики и лечения коклюша, создает пассивный иммунитет;

• агглютинирующие адсорбированные факторные сыворотки. Диагностические сыворотки, подвергнутые адсорбции родственными микробами с целью удаления групповых антител. Применяются для постановки РА при антигенной идентификации бордетелл.

Педиатрические аспекты темы

1. Коклюш - заболевание детского возраста. Бактериологичес­кая диагностика коклюша в ранний период заболевания основана на выделении чистой культуры возбудителя и ее идентификации. Для забора материала у детей используется метод кашлевых плас­тинок и применяются носоглоточные тампоны (у грудных детей). Серологическая диагностика коклюша, проводимая на 3 - 4 неде­лях заболевания (РСК) имеет эпидемиологическое значение. В настоящее время увеличился удельный вес заболеваний, вызванных Bordetella parapertussis, что обусловливает необходимость разграничения между этими микроорганизмами.

2. Пневмококки у детей могут вызвать сепсис, менингит. Дети первого года жизни не болеют крупозной пневмонией. Трудности при диагностике пневмонии у детей раннего возраста связаны с отсутствием спонтанного отделения мокроты.

Микробиологическая диагностика гемофильной инфекции

Возбудитель гемофильной инфекции - Haemophilus influenzae, способен вызывать гнойный менингит, острое воспаление верхних дыхательных путей, брон­хит, пневмонию, эмпиему, конъюнктивит, отит и другие оппор­тунистические заболевания. Уровень носительства гемофильной палочки среди здоровых лиц высокий (до 90 %). Гемофильная инфекция у детей в возрасте до 3 лет протекает исключительно тяжело, особенно в случае возникновения острого эпиглоттита (воспаления надгортанника).

Бактериоскопический метод может быть использован при исследовании спинномозговой жидкости при подозрении на гнойный менингит (рис.18а).

а б

Рис. 18. Гемофильная палочка - Haemophilus influenzae. а – мазок из спинно-мозговой жидкости, б - мазок из чистой культуры. Окраска по Граму. мелкие грамотрицательные палочки. х900

Бактериологический метод является основным в лабораторной диагностике гемофильной инфекции. Исследуемый материал (мокрота, кровь, спинномозговая жидкость, серозную жидкость) засевают на МПА с 6 - 10 % нативной крови или на «шоколадный» агар с прогретой или кипяче­ной кровью. Если возможности немедленно посеять матери­ал на среды нет, используют транспортную полужидкую среду с активированным углем и ниацином.

Серозную и спинномозговую жидкости центрифугируют, осадок засевают бактериальной петлей на шоколадный агар (МПА с 5% дефибринированной крови человека, лоша­ди или кролика выдерживают 2-3 минуты при температуре 80⁰ С, повторно добавляют 5% крови и вновь выдерживают при той же температуре 2-3 минуты) или среду Филдса (МПА с добавлением пептического перевара крови лошади или барана). Параллельно делают посев на обычный МПА, на котором гемофильная палочка не растет.

Колонии Haemophilus influenzae мелкие, прозрачные или полупрозрачные, вырастают через 18-24 часа; в мазках из этих колоний обнаруживаются мелкие капсулообразующие или капсулонеобразующие грамотрицательные палочки (рис. 17б). Оставшуюся часть колонии пересевают на скошенный шоколадный МПА для выделения чистой культуры. Идентификацию гемофильных бактерий проводят на основании изучения био­химических (каталазная, оксидазная активность, фер­ментация углеводов, гемолитическая активность, питательные потребности) и антигенных (постановка РА на стекле с групповыми сыворотками а,b,с, d, e, f к капсульному антигену) свойств.

Для идентификации Haemophilus influenzae применяют также тест са­теллитных колоний, для чего на поверхность шоколадного МПА наносят исследуемую культуру и в некоторые участки среды - штамм Staphylococcus aureus. Гемофильная палочка вырастает в виде мелких сателлитных колоний, окружающих колонии S. aureus, так как стафилококк, гемолизируя кровь, высвобождает X и V факторы – стимуляторы роста Haemophilus influenzae.

Каталазу гемофильной палочки определяют по пенообразованию в капле 10% перекиси водорода на предметном стекле при внесении в нее исследуемой культуры. Оксидазу выявляют путем нанесения на диск фильтроваль­ной бумаги, диаметром 5-7 см , 2-3 капель 1% раствора тетраметилпарафенилендиамина и исследуемой культуры, в результате чего через

10-15 сек. появляется фиолетовое окрашивание. Уреазу определяют общепринятым методом по разложению мочевины с образованием щелочных продуктов в присутствии индикатора фенолового красного; при наличии уреазы среда приобретает ярко-малиновый цвет. Порфириновый тест выявляет способность Н. influence к синтезу Δ-аминолевуленовой кислоты (АЛК) - потребности в фак­торе X. При внесении АЛК в среду только АЛК-независимые гемофильные бактерии синтезиру­ют и секретируют порфобилиноген и порфирины (проме­жуточные соединения биосинтеза гема), тогда как АЛК-зависимые гемофильные палочки, нуждающиеся в фак­торе X, не способны к образованию указанных продуктов. Исследуемые бактерии засевают на шоколадный МПА, наносят на поверхность среды диски, пропитанные АЛК, и после 24-часовой выращивания в термостате при 37⁰ С облучают УФ-лучами. При наличии Х-независимых микроорганизмов наблюдают кирпично-красную флюоресценцию.

Для специфической профилактики гемофильной инфекции в России лицензирована полисахаридная вакцина, конъюгированная со столбнячным анатоксином (вакцина Act-HIB) фирмы Пастер Мерье Коннот, которая не содержит консервантов и антибиотиков.