Бактериологический метод.

1. день. Посев крови на печеночного МПБ или на глюкозный МПБ с 2 % глицерина и антифаговой сывороткой.Культивирование посевов при 37⁰С до 30 дней в обычных условиях и в атмосфере 10% СО₂. Пересевы на скошенный пече­ночный МПА или эритрит-агар каждые 4-5 дней.

5-30 дни.Учет характера роста на пече­ночном МПА, эритрит-агаре (округлые, диаметром до 5 мм, серовато-белые, блестя­щие, прозрачные колонии) и глюкозном МПБ (помутнение и слизистый осадок). Пересев типичных колоний на скошенный МПА.

3 день. Проверка чистоты выделенной культуры, пересев на среды «пестрого» ряда для определения ферментативных свойств; постановка проб на фаголизабельность, чувствительность к антибиотикам и к бактериостатическому действию красителей. Идентификация по антигенной структуре в РА. Биопроба.

4 день. Заключение о виде выделенной культуры на основании ее идентификации по морфологическим, культуральным, ферментативным (биохимическая инертность), антигенным свойствам и фаголизабельности. Микроскопическое и бактериологическое исследование трупа животного, павшего в результате биопробы

Серологический метод

Постановка РНГА, РА (реакция Райта, Хеддльсона), РСК, РИФ, ИФА, реакции Кумбса (определение неполных антител) с целью определения антител в крови больного

Аллергодиагностика

постановка внутрикожной аллергической пробы Бюрне с бруцеллином. Учет через 24-48 часов.

Биопроба

Внутрибрюшинное или подкожное заражение материалом от больного морских свинок или белых мышей. Микроскопическое и бактериологическое исследование трупов павших животных

Генодиагностика. ПЦР

Серологический метод - постановка РА с сывороткой крови больного (реакция Райта, ставят в начале 2-й недели болезни, диагностический титр 1:200 и выше), ускоренной РА на стекле (реакция Хеддльсона), РСК и ИФА.

Диагностикумом в реакции Райта и Хеддльсона является взвесь убитых бруцелл с красителем генциановым фиолетовым или метиловым фиолетовым.

Реакцию агглютинации Хеддльсона ставят на стеклянной пластинке, на которую наносят микропипеткой неразведенную исследуемую сыворотку в количествах 0,08; 0,04; 0,02; 0,01 и 0,02 мл, добавляют по 0,03 мл бруцеллезного диагностикума, кроме по­следней дозы, в которую вносят 0,03 мл ФР (контроль сыворотки). Контролем диагностикума является смесь из 0,03 мл антигена и 0,03 мл ФР. Все капли перемешивают стеклянной палочкой или бактериологической петлей и после легкого покачивания стекла наблюдают за появлением мелкозернистого окрашенного агглютината. Отсутствие агглюти­нации во всех пробах сыворотки оценивается как отрицательная реакция, наличие агглютинации в 1-й пробе (0,08 мл сыворотки) - сомнительная, во 2-й (0,04 мл) - слабоположительная, в 3-й или 4-й пробах (0,02-0,01 мл) - положительная, во всех пробах - рез­ко положительная реакция. Поскольку реакция агглютинации Хеддльсона иногда бывает положительной у здоровых людей за счет нормальных антител, она обязательно подтверждается реакцией Райта.

РИФ, РНГА, РСК и особенно ИФА более чувствительны, чем реакция агглютинации. Для ранней диагностики бруцеллеза особую ценность имеет ИФА, позволяющий выявить в сыворотке больных антибруцеллезные антитела класса IgM, которые в отличие от IgG по­являются в ранние сроки болезни, свидетельствуя о свежем инфицировании.

Аллергический метод – постановка внутрикожной аллергической пробы Бюрне с 15-20 дня заболевания. Учет реакции проводится через 24-48 часов, положи­тельной считается реакция в случае появления на месте введения аллергена (бруцеллина) болезненности, гиперемии и инфильтрации кожи диаметром 3 см и более. Положительная аллергическая ре­акция на бруцеллин сохраняется в течение длительного времени после перене­сенного бруцеллеза, а также после прививки.

Бактериологический метод - посев крови для выделения гемокультуры в 2 флакона с 50 мл печеночного или асцитического бульона (рН 7,1-7,2) или МПБ с добавлением 1 % глюко­зы, 2 % глицерина и антифаговой сыворотки (для инактивации бруцеллезного бактериофага) в первые дни болезни при наличии лихорадки. При отрицательных резуль­татах исследование повторяют, т.к. бактериемия наблю­дается в течение 1 года и более.

Один флакон выращивают в обычных аэробных условиях, другой — в герметично закрытом сосуде с 10 % углекислого газа (или СО₂-инкубаторе) при температуре 37⁰ С до 1 ме­сяца, делая пересевы на скошенный пече­ночный агар или эритрит-агар каждые 4-5 дней. На жидких средах бруцеллы растут с образованием легкого помутнения и небольшого слизистого осадка, на плотных средах в виде округлых, диаметром до 5 мм, серовато-белых, блестя­щих, прозрачных с янтарным оттенком в проходящем свете колоний. Типичные колонии пересевают на скошенный агар и идентифицируют выделенную культуру до уровня вида.

Выполняются также посевы ис­следуемого материала в желток свежего куриного яйца или в жел­точный мешок куриного эмбриона с последующей их инкубацией в течение 5 дней при 37⁰С и пересевом содержимого желточного мешка на плотные и жидкие питательные среды для выделения чистой культуры бруцелл.

Бруцеллы идентифицируют на основании изучения морфологических (рис. 13 - грамотрицательные коккобактерии), культуральных, биохимических (они не ферментируют уг-

Рис. 13. Возбудитель бруцеллеза (Brucella melitensis). Окраска по Граму. Мелкие грамотрицательные коккобактерии.

леводы, не свертывают молоко и не разжижают желатину, выделяют сероводород), антигенных свойств (постановка РА с моноспеци­фическими сыворотками против антигенов А, М, R), чувствительности к специфическому бактери­офагу и бактериостатическому действию анилиновых красителей (табл. 8).

Таблица 8. Дифференциация основных видов бруцелл

Признак	Вид бруцелл
	Br. melitensis	Br. abortus	Br. suis
Условия культивирования	аэробные	10% СО2	аэробные
Рост на средах с красителями:
фуксином 1:50000	+	+	-
тионином 1:25000	+	-	+
пиронином 1:200000	+	+	-
Образование Н2S	-	±	±
РА с монорецепторными сыворотками
А	±	±	+
М	±	±	±
Чувствительность к бруцеллезному фагу	-	+	±

. Обозначения: «-« - отрицательная; «+» - положительная; «±» - непостоянная реакции.