Тема 8. Возбудители бактериальных воздушно-капельных инфекций: дифтерии, коклюша, гемофильной и пневмококковой инфекции Лабораторная диагностика дифтерии

Дифтерия - острое инфекционное заболевание, вызываемое дифтерийной палочкой (Corynebacterium diphtheriae), характеризующееся местным фибринозным поражением слизистых оболочек рото- и носоглотки (diphthera – пленка), а также тяжелой интоксикацией с поражением сердечно-сосудистой, нервной системы и надпочечников. Лабораторная диагностика дифтерии осуществляется в соответствии со схемой 14.

С

Материал для исследования: отделяемое со слизистой оболочки зева и носа, пленки с поверхности миндалин.

Бактериологический метод

1 день.Посев материалана среду Клауберга. Культивирование в течение суток при 37⁰ С.

2 день. Учет характера роста колоний на среде Клауберга (серовато-черного цвета колонии с радиальной исчерченностью в виде цве­тка маргаритки или розетки -биовар gravis; черные, круглые, выпуклые колонии за счет восстановления теллурита - биовар mitis). В мазке из типичной для дифтерийной палочки колонии (окраска по Нейссеру) палочки булавовидной формы, расположенные в виде римских цифрVили Х, содержащие зерна волютина. Пересев оставшейся части колонии на кровяной МПА для выделения чистой культуры; посев на сывороточный МПА для определения токсигенности, постановка пробы на цистиназу.

3 день. Учет проб на токсигенность, цистиназу. Формулировка ответа. Пересевы с кровяного МПА на специальные среды с целью полной идентификации дифтерийной палочки и ее дифференциации от сходных непатогенных коринебактерий.

4 день. Окончательный ответ.

хема 14. Микробиологическая диагностика дифтерии

Серологический метод

Постановка РА, РНГА с целью выявления антител к дифтерийной палочке и ее токсину, а также динамики антител (исследование парных сывороток) в процессе инфекции.

Микроскопический метод в настоящее время фактически не применяется из-за его низкой информативности в связи с субъективизмом учета и выполняется только по требованию лечащего врача. Микроскопии подвергают мазки, окрашенные по Граму, метиленовым синим, по Нейссеру (для выявления включений волютина). Дифтерийные палочки (Corynebacterium diphtheriae) при окраске по Нейссеру содержат полярно расположенные темно-синие, почти черные, включения волютина и располагаются в виде римских цифр V или Х, тогда как сходные с ними дифтероиды и ложнодифтерийные бактерии (Corynebacterium pseudodiphtheriae) зерен волютина не имеют и располагаются в виде частокола. Разработан также метод прямого флюорохромирования дифтерийных палочек корифосфином, окрашивающим включения волютина в красно-коричневый цвет, а цитоплазму в зеленый или желтый цвет, что позволяет повысить эффективность бактериоскопического метода.

Бактериологический метод - основной метод диагностики дифтерии. Исследуемый материал засевают на одну из специальных питательных сред для культивирования дифтерийных палочек, наиболее часто на среду Клауберга (МПА с гли­церином, дефибринированной кровью и теллуритом натрия, задерживающим рост сопутствующей непатогенной микрофлоры). На среде Клауберга Corynebacterium diphtheriae образует 2 типа колоний:

а) серовато-черного цвета с радиальной исчерченностью поверхности, напоминающие цве­ток маргаритки или розетку (биовар gravis);

б) черные, круглые, выпуклые колонии колонии за счет восстановления теллурита (биовар mitis).

В мазке из типичной для дифтерийной палочки колонии обнаруживают грамположительные палочки булавовидной формы, расположенные в виде римских цифр V или Х, содержащие зерна волютина (рис. 16). Оставшуюся часть колонии пересевают на кровяной МПА для выделения чистой культуры.

Рис. 16. Возбудитель дифтерии - Corynebacterium diphtheriae. Окраска по Нейссеру. Расположение в виде римских цифр V или Х, включения волютина по полюсам. х900

Идентификацию выделенной культуры проводят с учетом, прежде всего, ключевых свойств (токсигенность, наличие цистиназы). Токсигенность обычно определяют с помощью реакции преципитации в геле («чашечный» метод). Для этого в чашку Петри с питательной средой (МПА, 15—20 % лошадиной сыворотки, 0,3 % мальтозы, 0,03 % цистина) накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную анти­токсической противодифтерийной сывороткой (5000 АЕ/мл), чашку подсушивают 30 минут в термостате, после чего засевают штрихами исследуемые культуры перпендикулярно полоске бумаги. В качестве контроля используют токсигенную куль­туру. Посевы инкубируют в термостате при 37⁰ С в течение 18-20 часов. При наличии токсигенности в местах соединения ток­сина с антитоксическими антителами в питательной среде образуются белые линии преципитата, напоминающие усики. Для определения токсигенности дифтерийных бактерий также разработаны ИФА и ПЦР.

Цистиназу у выделенных культур (проба Пизу) определяют путем посева методом укола петли исследуемой культуры на цистиновый МПА с азотнокислым свинцом. Посевы помещают на сутки в термостат при 37⁰ С. При наличии цистиназы в среде образуется почернение (образование сульфида свинца) по ходу укола, вокруг которого появляется коричневое облачко.

Выделенную культуру идентифицируют и дифференцируют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по биологическим свойствам (табл. 16). Для определения уреазы петлю исследуемой культуры вносят в пробирку, содержащую спиртовый раствор мочевины и индикатор феноловый красный. Пробирку выдерживают 30 минут в термостате при 37⁰ С, при наличии уреазы содержимое пробирки окрашивается в красный цвет.

При выделении нетоксигенной культуры ставят реакцию агглютинации с противодифтерийной сывороткой для выявления видового антигена Corynebacterium diphtheriae.

Серологический метод – РА, РНГА с целью определения антител в парных сыворотках крови больных дифтерией.

Таблица 16. Биологические свойства коринебактерий

Вид	Волютин	Гемолиз	ферментация			токсин	цистиназа	уреаза	РА с ПДС
			сахарозы	глюкозы	крахмала
C. diphtheriae биовар биовар	+ +	- +	-	+ +	+ -	± ±	+ +	- -	+ +
C.xerosis	±	-	+	+	-	-	-	-	-
C. pseudodiphtheriae	±	-	-	-	-	-	-	+	-