Тема 9. Генетика микроооганизмов. Самостоятельная работа студентов

1. Опыт по выявлению действия низких концентраций фенола на подвижность бактерий (модификационная изменчивость). Подвижную культуру P.vulgaris засевают по методу Шукевича на скошенный агар с добавлением 1% фенола. Через сутки инкубации в термостате при 37⁰С выполняют пересев по методу Щукевичу на скошенный агар. Демонстрация: сре­да № I - посев исходной культуры протея. Наблюдается ползучий рост по всей скошенной поверхности - культура подвижна. Сре­да № 2 - с добавлением фенола - рост только в мес­те нанесения культуры (культура неподвижна). Среда № 3 - пе­ресев со среды с фенолом на среду без фенола - рост по всей скошенной поверхности (культура подвижна). Произошла реверсия признака. Делается вывод о модификационном характере изменчи­вости протея.

2. Изучение характера роста s (e.Coli) и r (b. Cereus) форм бактерий на плотной и жидкой питательных средах (демонстрация).

3. Индукция мутаций под действием ультрафиолетового (УФ) облучения (демонстрация). Объект облучают при красном свете бактерицидной лампой ВУФ-15 на расстоянии 60 см от его центра.

Предварительно определяют бактерицидную дозу УФ-облу­чения, устанавливая оптимальную мутагенную дозу (0,1—1 % от числа выживших бактерий).

Для получения lac-мутантов Е.coli испытуемую культуру, содержащую 2х 10⁸ бактерий в 1 мл среды, выращивают в питательном бульоне в течение 14—18 ч. Бактерии осаждают центри­фугированием, ресуспендируют в 40 мл 0,1 моль 1 л раствора MgSО₄ и охлаждают во льду (для прекращения деления клеток). Затем суспензию в объеме 50 мл помещают в стерильную чашку Петри и облучают в течение 15—150 сек., после чего клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в таком же объеме пита­тельного бульона и инкубируют при 37 °С в течение 14—18 часов. Затем из разведения 10²—10⁵ по 0,1 мл высевают на плотную селективную питательную среду (среда Эндо) в чашки Петри и растирают шпателем.

Для выделения антибиотикорезистентных мутантов исполь­зуют штамм E.coli В или К12, который высевают после облуче­ния на минимальный агар с определенной концентрацией антибиотика. Например, ампициллин—10 мкг/мл, левомицетин— 5 мкг/мл, пенициллин — 100 мкг/мл.

На среде Эндо lac-мутанты Е. coli образуют бесцветные ко­лонии. Клетки Е. coli, выросшие на среде с указанной концент­рацией антибиотика, являются к нему резистентными. Парал­лельно делают контрольные посевы.

4. Опыт трансформации (демонстрация). Реципиентом является стрептомициночувствительный штамм сенной палочки - Escherichia coli Str^s , донором - ДНК, выделенная из штамма Escherichia coli Str^r , устойчивого к стрептомицину. Селективной средой для отбора рекомбинантов служит питательный агар со стрептомицином (100 ЕД/мл).

К 1 мл бульонной культуры В. subtilis добавляют 1 мкг/мл ДНК донора, смесь инкубируют при 37 °С в течение 30 мин, после чего в пробирку вносят смесь 0,1 мг/мл раствора ДНКазы (для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма), и вновь инкубируют в течение 5 мин. Для определения количества образовавшихся стрептомицинустойчивых рекомбинантов 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Для определения количества клеток реципиентной культуры готовят ее десятикратные разведения в изотоническом растворе хлорида натрия до 10^–5 – 10^-6 (для получения сосчитываемого количества колоний), высевают по 0,1 мл на питательный агар без стрептомицина, а для контроля - на агар со стрептомицином. Посев инкубируют при 37 °С. На следующий день учитывают результаты опыта и определяют частоту трансформации по отношению количества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма. На среде со стрептомицином реципиентная культура не должна расти, т.к. она чувствительна к стрептомицину. Частота трансформации определяется отношением количества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма .

5. Опыт специфической трансдукции (демонстрация). Реципиентом является штамм Е. coli lac^-, лишенный β-галактозидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг—фаг λ dgal, часть генов которого замещена дефектным β -галактозидазным опероном Е. сoli, неспособным вызывать лизис кишечной палочки. На селективной среда Эндо лактозоотрицательные колонии бактерий реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозоположительные колонии рекомбинантного - красные колонии с металлическим блеском.

К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага λ dgal (концентрация 10⁶—10⁷ бактерий в 1 мл). Смесь инкубируют при 37 °С в течение 60 мин, затем готовят ряд десятикратных разведении. Из пробирки с разве­дением 10⁶ делают высев по 0,1 мл культуры на три чашки Пет­ри со средой Эндо и равномерно распределяют жидкость шпате­лем по поверхности среды. Посевы инкубируют в течение суток, после чего отмечают результаты опыта и вычисляют величину трансдукции по отношению количества клеток рекомбинантов (трансдуктантов), обнаруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентного штамма. Частота трансдукции определяется отношением числа клеток рекомбинантов к числу клеток реципиентного штамма.

6. Опыт конъюгации с целью передачи фрагмента хромосомы, содержащего ген leu, контролирующего синтез лей­цина (демонстрация). Донор — штамм Е. coli K12 Hfr leu⁺ Str^s. Реци­пиент—штамм E. coli K12F^- leu^- Str^r. Селективная среда для выделения рекомбинантов — минимальная глюкозосолевая сре­да со стрептомицином. К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют I мл буль­онной культуры донора. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 30 мин, затем смесь разводят до 10^–2 - 10^-3 и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки Петри, на кото­рой вырастут только колонии рекомбинантов. В качестве конт­роля на ту же среду высевают штам­мы донора и реципиента, которые не будут расти на ней, так как первый штамм чув­ствителен к стрептомицину, а второй ауксотрофен по лейцину. Культуру донорского штамма высевают также на селектив­ную среду без стрептомицина, а культуру реципиентного штам­ма—на полную среду (питательный агар с антибиотиками) для определения числа жизнеспособных клеток. Посевы инкубируют доследующего дня при 37 °С. После подсчета числа выросших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению коли­чества рекомбинантных клеток к реципиентным.

7. Определение Col-плазмид (колициногенных факторов - демонстрация). Ис­следуемые культуры Е.coli засевают методом укола в питатель­ный агар в чашке Петри (по 7—8 уколов на 1 чашку). Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток, после чего на внутреннюю поверхность чашки помещают кусочек ваты, смоченный хлоро­формом, в парах которого погибают бактерии. Затем по поверх­ности агара равномерно распределяют 3 мл расплавленного и остуженного до 45⁰ С полужидкого (0,7 %) питательного агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой бульонной индикаторной куль­туры. Через 18—24 ч инку­бации посевов при 37⁰ С учитывают результаты опыта. Вокруг посевов исследуемых культур, продуцирующих колицины, появ­ляются прозрачные зоны подавления роста индикаторного штамма бактерий.

8. Определение колицинотипа (демонстрация). В питательный агар в чашки, Петри методом укола засевают эталонные штаммы бактерий с известным колициногенотипом. Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток, после чего бактерии убивают парами хлорофор­ма. Затем по поверхности агара равномерно распределяют 3 мл расплавленного и остуженного полужидкого агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой бульонной культуры Е. coli неизвестного колициногенотипа (например. Col A, Col В и др.). Результаты опыта учитывают через 18—24 ч, от­мечая наличие или отсутствие роста. Исследуемая и индикаторная культуры имеют один и тот же колициногенотип, т. е. содержат идентичные Col-плазмиды. При несовпадении колициногенотипа вокруг эталонных штаммов появляются зоны задержки роста бактерий.

Молекулярно-генетические методы идентификации микроорганизмов ос­новываются на анализе нуклеиновых кислот микроорганизмов.

1. Рестрикционный анализ. Сущность метода заключается в обработке ДНК рестрикционными ферментами (специфическими эндонуклеазами), разрезающими молекулу ДНК по определенным последовательностям нуклеотидов. После этого анализируют полу­ченные фрагменты, специфические для каждого вида или варианта микроорга­низма.

2. Гибридизация ДНК. Метод основан на определении уникальных последовательностей генома микроорганизма, отражающих свойства вида или варианта. Сущность обнаружения таких участков ДНК основана на способ­ности комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот к гибридизации. Исследование проводят с помощью меченых ферментом, радионуклидом или флюорохромом нуклеиновых зондов, представляющих однонитевые фрагменты ДНК, ком­плементарные уникальным участкам микробного генома. Основной облас­тью применения является идентификация трудно культивиру­емых или медленно растущих микробов (например, представи­телей родов Mycobacterium, Neisseria, Campylobacter). Метод молекулярной гибридизации требует большого количества молекулярных зондов, времени, сложен в постановке, не отличается высокой чувствительностью и широкого практического применения не нашел.

Самостоятельная работа студентов сводится к учету демонстрационной реакции гибридизации, поставленной при хламидиозе.

3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР позволяет обнаруживать уникальные (специфические) участки ДНК, находящиеся в исследуемом образце в очень малых количествах. Сущность ПЦР основана на амплификации (увеличении) числа копий искомого участка генома микроорганизма, причем для идентификации вида микроорганизма теоретически достаточно одной копии искомой уникальной последователь­ности.

С этой целью образец инкубируют в буферном растворе с двумя ко­роткими ДНК-олигомерами (праймерами), комплементарны­ми концам известного уникального фрагмента генома, термостабильной ДНК-полимеразой и нуклеотидами. После гибридизации олигомеров с комплементарными участками ДНК они служат праймерами для полимеразы, которая копирует искомый фраг­мент. Образец многократно (20-40 раз) нагревают для разделения цепей двойной спирали ДНК и охлаждают для повторной гибридиза­ции праймеров с комплементарной матрицей, при этом каждая копия участка ДНК становится новой матрицей для синтеза следующей копии. Количество копий искомого фрагмента генома в результате амплификации увеличивается экспоненциаль­но. Амплификация в миллионы раз занимает всего несколько часов.

ПЦР широко используется в диагностических целях. Достоинства ПЦР как метода диагностики инфекционные заболеваний заключаются в следую­щем:

1. ПЦР дает прямые указания на присутствие возбудителя в исследуемом материале без выделения чистой культуры.

2. Метод обладает очень высокой чувствительностью (от нескольких до одного возбудителя в пробе) и 100% специфичностью. Количество исследуемого материала может составлять несколько десятков микро­литров.

3. Исследуемый материал может быть дезинфицирован с помощью химических или термических методов, что исключает инфицирование персонала в процессе проведе­ния ПЦР.

4. Простота исполнения, возможность полной автоматизации, быстрота получения результатов (4-5 часов) позволяет отнести ПЦР к экспресс-методам диаг­ностики.

Студенты производят учет демонстрационной ПЦР, поставленной при уреаплазмозе (рис. 12).