Микроскопический метод

Микроскопия окрашенных по Граму и метиленовым синим мазков из материала от больного с целью обнаружения биполярно ок­рашенных грамотрицательных овоидных бактерий, окруженных нежной капсулой и дающих специфическое све­чение оболочки в РИФ

Бактериологический метод.

1. день.Посев на МПБ, кровяной МПА с антифаговой сыво­роткой, раствором генцианового фиолетового и сульфита натрия, селективную среду с антибиотиками (агарCIN). Инкубация посевов при 25-28⁰С.

2 день Учет характера роста под малым увеличением микроскопа (рост колоний в виде скоп­ления осколков битого стекла; через 48 часов появление R-форм в виде «кружевных платочков»; в жидких средах рост, напоминающий сталактиты). Микроскопическое исследование типичной колонии, ее пересев на скошенный МПА для накопеления чистой культуры.

3 день. Проверка чистоты выделенной культуры, пересев на среды «пестрого» ряда для определения ферментативных свойств, постановка проб на фаголизабельность и чувствительность к антибиотикам. Идентификация культуры по антигенным свойствам (выявление капсульного и соматического антигенов).

4 день. Заключение о виде выделенной культуры на основании ее идентификации по морфологическим, культуральным, ферментативным, антигенным свойствам и фаголизабельности.

Серологический метод

Постановка РНГА, ИФА, РИФ, РНАг с целью определения антител в крови больного

Биопроба

Подкожное, внутрибрюшинное, накожное или скарификационное заражение материалом от больного морских свинок или белых мышей. Микроскопическое и бактериологическое исследование трупов павших животных

Генодиагностика

Постановка ПЦР

А б

Рис. 7. Возбудитель чумы (Yersinia pestis). а - чистая культура, окраска метиленовым синим. Палочки овоидной формы, окрашенные биполярно.х 630. б – мазок из материала от больного, окраска по Граму. Грамотрицательные, биполярно окрашенные, капсулообразующие палочки овоидной формы. х1350

Типичные колонии пересевают на скошенный МПА, чистую культуру чумных бактерий идентифицируют по морфологическим, культуральным, ферментативным, антигенным свойствам (РА с использованием диагностических сывороток против высокоспецифичного капсульного и соматического антигенов), фаголизабельности, определяют ее чувствительность к антибиотикам. Возбудитель чумы восстанав­ливает нитраты в нитриты, ферментирует глюкозу, ксилозу, маннит с образованием кисло­ты (без газа). В отличие от многих других представителей семейства энтеробактерий имеет более низкий темпера­турный оптимум роста и физиологической активности - 28 °С. В процессе идентификации возбудитель чумы необходимо дифферен­цировать с другими иерсиниями (табл. 6).

Биологическое исследование. Заражают морских свинок или мышей подкожно, внутрибрюшинно или накожно, материалом от трупов – методом скарификации.

Животные погибают на 2—7-е сутки. Одно из зараженных животных умерщвляют на 2—3-й день с целью выделения культуры иерсиний из крови и внутренних органов. В мазках из внутренних органов, крови, экссудата погибших животных обнаруживают большое количество грамотрицательных, биполярно окрашенных бактерий. После исследования трупы животных погружают в 5% лизол, а затем сжигают.

Рис. 8. Колонии возбудителя чумы (Yersinia pestis). х56

Таблица 6. Биологические свойства иерсиний

Свойства	Y. pestis	Y. pseudotuberculosis	Y. enterocolitica
Подвижность при: 25^0 С 28-37^0С	- -	+ -	+ -
Ферментация: рамнозы раффинозы инозита мочевины сахарозы	- - - - -	+ + - + -	- - + + +
уреаза орнитиндекарбоксилаза	- -	- -	+ -
Фракция 1	+	-	-
Мышиный токсин	+	-	-
Пестицин 1	+	-	-
Плазмокоагулаза	+	-	-
Фибринолизин	+	-	-
Чувствительность к чумному фагу	+	-	-
Вирулентная форма колоний	R	S	S

Серологическое исследование проводится с целью ретроспективной диагностики чумы. Ставят РНГА с эритроцитами, на которых адсорбирован капсульный антиген возбудителя чумы, реакцию нейт­рализации антигена (РНАг), ИФА и непрямую РИФ. Диагностический титр 1:40 и выше.

Генодиагностика. Разработана ПЦР для экспресс-диагностики чумы.