Тема 3. Морфология и классификация бактерий, спирохет, риккетсий, хламидий, микоплазм и актиномицетов. Самостоятельная работа студентов

1. Люминесцентная микроскопия. Окраска спор путем прямого флюорохромирования. Конструктивные особенности люминесцентного микроскопа состоят в наличии мощной осветительной лампы (например, ртутно-кварцевой), а также специальных светофильтров (возбуждающий люминесценцию синий фильтр, расположенный за источником освещения, а также «запирающий» фильтр на окуляре). Люминесцентная микроскопия имеет ряд преимуществ перед обычной световой микроскопией, в частности, возможностью исследования живых микроорганизмов, обнаружения их в материале в небольших количествах, наличием цветного изображения. Как правило, исследуют вторичную (наведенную) люминесценцию микроорганизмов при окраске их специальными люминесцирующими красителями – флюорохромами (наиболее часто используют изотиоцианат флюоресцеина, акридин оранжевый, аурамин, родамин и т.д.). В иммунофлюоресцентном методе исследования применяют сыворотки или антигены, меченые флюорохромами.

Студенты изучают демонстрационный препарат спор, окрашенный методом прямого флюорохромирования (В.А.Ро­манов и В. Н.Язынин,1981). Методика окраски: препараты, приготовленные из культуры сенной палочки (Bacillus subtilis), обрабатывают водным раствором аурамина в концентрации 1:1000 в течение 2 минут. Затем препарат обесцвечивают 0,5% раствором серной кис­лоты в течение 30 сек. и после промывки докрашивают в течение I минуты водным раствором родамина 6ж в концентрации 1:5000. Высушенные препараты просматривают в люминесцентном микроскопе. На фоне красно-кирпичного свечения вегетативных форм бак­терий, окрашенных родамином, выявляются овальные, слегка вытянутые споры ярко-зеленого или желтого цвета.

2. Органы подвижности бактерий – жгутики. Изучить демонстрационный препарат культуры протея - Proteus vulgaris, окрашенный серебрением по Морозову. В ходе обработки (разрыхление протра­вой - танин с фенолом с последующей импрегнацией серебром) жгу­тики увеличиваются в диаметре, достигая пределов разрешающей способности иммерсионного микроскопа. Окружая тело микроба со всех сторон, они свидетельствуют о принадлежности протея к перитрихам.

3. Выявление подвижности протея методом «раздавленной капли».

Методика приготовления препарата:

• на середину предметного стекла наносят каплю бульонной культуры вульгарного протея. Каплю осторожно покрывают покров­ным стеклом, не допуская образования между стеклами пузырьков воздуха;

• препарат микроскопируют сухой системой, с использованием объектива х40. Оптика микроскопа должна быть очень чисто про­терта, конденсор слегка опущен, а его диафрагма прикрыта с целью затемнения поля зрения.

• протей является перитрихом, передвигается в поле зрения беспорядочно. Важно не спутать характер его движения с пас­сивным перемещением в результате броуновского движения - бес­порядочного колебания клеток.

4. Изучение подвижности протея (Proteus vulgaris) в препарате «висячая капля» с использованием фазово-контрастной микроскопии (демонстрация). Фазово-контрастное устройство предназначено для микроскопии живых неокрашенных объектов. Устройство комплектуется специальными объективами с фазовыми кольцами, а также специальным фазовым конденсором с револьвером специальных кольцевых диафрагм для каждого объектива. Фазово-контрастное устройство переводит невиди­мые фазовые изменения пучка света в контрастные амплитудные, создавая контраст между неокрашенным микроорганизмом и окружа­ющей средой, а также в структуре самих микробов.

Препарат висячей капли готовят, нанося в центр покровного стекла каплю исследуемого материала. Предметное стекло с лункой, края которой смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. После этого препарат переворачивают покровным стеклом вверх; капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии сначала используют объектив «малого» увеличения (х8) для нахождения края капли, после чего определяют подвижность бактерий с помощью объектива «большого» увеличения (х40) или иммерсионной микроскопии.

5. Морфология боррелий – возбудителей возвратного тифа (Borrelia recurrentis). Мазок из крови больного возвратным тифом (демонстрация). Окраска по Романовскому - Гимза. Краситель состоит из смеси азура-2 (продукт окисления метиленового синего) и эозина. Среди эритроцитов заметны тонкие лиловые удлиненные спирохеты, образующие до 9 крупных неравномерных завит­ков.

6. Морфология возбудителя сифилиса (Treponema pallidum). Окраска по Бурри (тушевой препарат). На темном фоне видны бесцветные трепонемы с 8 - 12 равномерными завитками.

7. Морфология и подвижность лептоспир - Leptospira interrogans. Темнопольная микроскопия (демонстрация). Представители этого рода имеют тонкие частые неглубокие завитки и обладают своеоб­разным движением, во время которого концы вращаются под углом к основной части тела. В стадии покоя имеют форму крючка. В темнопольном микроскопе используются специальные конденсоры (параболоид-конденсор с затемнением в центре и внутренней зеркальной поверхностью для отражения лучей света, либо кардиоид-конденсор, в котором лучи света отражаются сначала от выпуклой поверхности, а затем от вогнутой). Темнопольные конденсоры создают эффект бокового освещения, в ре­зультате чего на темном фоне видны светящиеся микроорганизмы.

Морфология спирохет представлена на рис. 9.

Рис. 9. Спирохеты. а – трепонемы; б – боррелии; в - лептоспиры

1. Морфология риккетсий – возбудителей эпидемического сыпного тифа (Rickettsia provazeki). Окраска по Здро­довскому.

Методика окраски:

• Окраска мазка фуксином Циля в течение 5 минут.

• Промывание водой.

• Обработка мазка 0,01% раствором хлористоводородной кислоты.

• Промывание водой.

• Окраска метиленовым синим в течение 1 минуты.

• Промывание водой, высушивание, микроскопия.

Риккетсии, окрашенные по этому методу, выглядят в виде мелких полиморфных микроорганизмов рубиново-красного цвета.

9. Хламидии (Chlamidia trachomatis) в мазках из уретры больных урогенитальным хламидиозом (внутри - и внеклеточное расположение). Демонстрационный препарат, окрас­ка по Романовскому-Гимза.

Рис. 10 Риккетсии. 1- кокковидные; 2 – палочковидные; 3 – нитевидные; 4 – размножение в цитоплазме эукариотических клеток.

10. Актиномицеты в материале от больного актиномикозом (окраска по Романовскому-Гимза). Зарисовать типичные для этого заболевания друзы актиномицетов, отметить лучистую структуру актиномицетов.

Рис. 11. Актиномицеты