Серологический метод: Постановка ра, рнга, теста иммобилизации вибрионов с целью выявления антител к холерному вибриону и их динамики (исследование парных сывороток) в процессе инфекции.

Экспресс-методы: прямая и непрямая РИФ, РНГА с иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами, реакция иммобилизации вибрионов с противохолерными сыворотками с целью обнаружения холерного вибриона в исследуемом материале.

Четвертый этап. (через 18-24 ч от начала анализа). Изучают и отбирают с помощью стереомикроскопа типичные для холерного вибриона колонии на всех плотных средах. Хо­лерный вибрион образует прозрачные, круглые, диаметром 1-2 мм, гладкие, пло­ские, го­могенные, с ровными краями колонии, имеющие голубоватый оттенок и маслянистую кон­систенцию. На агаре TCBS колонии холерного вибриона ярко-желтые на зеленом фоне среды, на сре­де Монсура — полупрозрачные бесцветные с темным центром. Колонии проверяют на наличие оксидазы (холерные вибрионы оксидазоположительны), ставят РА на стекле с холерны­ми сыворотками О-1, О-139 и RO, а также специфическую иммунофлюоресценцию.

Положительная РА или ИФМ в сочета­нии с типичными морфологическими, тинкториальными и культуральными свойствами выделенной культуры позволяет вы­дать предварительный положительный ответ.

Пятый этап проводится через 24 —36 ч от начала исследования. На этом этапе изучают и отбирают характерные для холерного вибриона культуры на среде Ресселя, на которой холерный вибрион расщепляет сахарозу, что сопровождается покраснением среды в столбике без образования газа, но не ферментирует лактозу (отсутствие изменений скошенной части среды). Со среды Ресселя готовят мазки в окраске по Граму с целью обнаружения характерных по морфологическим свойствам вибрионов, проверяют наличие подвижности и оксидазы, ставят РА с холерными сыворотками (О-1, RO, Огава, Инаба, при отрицательном результате - с сывороткой О-139) и при наличии положительных результатов выдают ответ о выделении соответствующего холерного вибриона.

Окончательную идентификацию оксидазопопожительных культур проводят, используя сокращенную или полную схемы (табл. 15).

Таблица 15. Дифференциация холерных вибрионов

Тесты	V.cholerae asiaticae	V.cholerae el-tor	НАГ
Агглютинация О-сывороткой	+	+	-
Агглютинация сыворотками Инаба и Огава	+	+	-
Лизис фагами: Холерный фаг С (фаг IV) Фаг Эль-Тор	+ -	- +	+ +
Агглютинация куриных эритроцитов	-	+	+
Гемолиз эритроцитов барана	-	+	+
Рост на среде с полимиксином	-	+	+
Гексаминовый тест	-	+	+
Реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола)	-	+	+

Сокращенная схема предполагает постановку развернутой РА с сыворотками Инаба и Огава, пробы с диагностическими холерными фагами, определение ферментативной группы по Хейбергу. Полная схема дополнительно включает тесты для дифференциации биоваров холерного вибриона (классического и Эль-Тор), в частности, определение гемагглютинирующих и гемолитических свойств, чувствительности к полимиксину, способности давать положительную реакцию Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола - ацетоина из глюкозы). Ацетоин определяют добавлением в культуру, выращенную на глюкозо-фосфатном бульоне Кларка, 5% α-нафтола и 40%-го гидроксида калия; при встряхивании пробирок среда окрашивается в розовый или рубиново-красный цвет.

Для ускоренной биохимической идентификации холерных вибрионов и их дифференциации от холероподобных и нехолероподобных вибрионов используют систему индикаторных бумажных дисков (СИБ), в состав которой входят тесты на оксидазу, индол, ферментацию лактозы, глюкозы, саха­розы, маннозы, арабинозы, маннита, инозита, аргинина, лизи­на и орнитина.

Шестой этап (выполняется через 36-48 ч от начала анализа) - окончательная идентификация выделенных куль­тур, определение их чувствительности к антибиотикам, формулировка окончательного ответа о выделении холерного вибриона с указанием биовара, серогруппы (серовара) и эпидемической значимости по косвенным биологическим признакам (гемолитической активности, группе Хейберга и др.). Типичные куль­туры Vibrio cholerae представляют собой грамотрицательные изо­гнутые в виде запятой или прямые полиморфные активно подвижные палочки, обладающие оксидазой, разлагающие глюкозу с образованием кислоты без газа, декарбоксилирующие лизин и орнитин, но не ферментирующие аргинин, принадлежа­щие к 1-й (реже 2-й) группе Хейберга, агглютинирующиеся хо­лерными сыворотками и лизирующиеся диагностическими фагами. Если выделенная культура не агглютинируется сыворотками к О1 и О139, ее относят к группе НАГ-вибрионов, а при наличии соответствующих сывороток определяют ее принадлежность к другой серогруппе. Токсигенные штаммы холерных вибрионов серогрупп О и О139 обычно не лизируют бараньи эритроциты, относятся к 1-й группе Хейберга (ферментируют маннозу и сахарозу, но не арабинозу), лизируются определенными фагами в комплексном методе с применением ХДФ.

Вирулентность холерных вибрионов определяют в специализированных лабораториях путем внутрикишечного заражения кроликов-сосунков, а также методами генодиагностики (ПЦР или ДНК-ДНК-гибридизация с целью определения гена, ответственного за выработку токсина).

Серодиагностика являет­ся дополнительным методом лабораторной диагностики холеры. Исследуют пар­ные сыворотки крови больных, взятые с интервалом в 6-8 дней, с целью выявления агг­лютининов с помощью РА (диагностический титр 1:40 и выше), антитоксинов с помощью РНГА с эритроцитарным холерным энтеротоксическим диагностикумом (диагностический титр - 1: 160) и вибриоцидных антител с помощью реакции иммобилизации вибрионов (диагностический титр1:1000). Учитывается также нарастание титра антител (не менее чем в 4 раза) в процессе инфекции.

Экспресс-диагностика - прямая и непрямая РИФ с использованием специфических О-холерных сывороток серогрупп 01 и 0139, меченых изотиоцианатом флюоресцеина; РНГА со специфическими иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами. Ставят также реакцию иммобилизации вибрионов с теми же сыворотками (2 капли материала наносят на предметное стекло, в одну из них вносят каплю сыворотки О1 или О139 в разведении 1: 100, в другую каплю ФР - контроль). Готовят препараты «раздавленной» капли, которые исследуют с помощью темнопольного, фазово-контрастного или обычного микроскопа с опущенным конденсором при увеличении 400 - 600. Положительная реакция характеризуется по­терей подвижности вибрионов и их склеиванием.

Самостоятельная работа студентов

1. Микроскопический метод. Промикроскопировать и зарисовать демонстрационный микропрепарат холерного вибриона V.cholerae, окрашенный по Граму. Холерный вибрион - грамотрицательная изогнутая палочка.

2. Бактериологический метод. Ознакомиться с ос­новными биологическими свойствами классического биовара холерного вибриона и биовара Эль-Тор:

• фаголизабельность. Классический холерный вибрион лизируется фагом С и нечувствителен к действию фага Эль-Тор II. Вибрион Эль-Тор лизируется фагом Эль-Тop и нечувствителен к фагу С (демонстрация);

• чувствительность к полимиксину. Учесть рост классического холерного вибриона и вибриона Зль-Тор на среде с добавле­нием полимиксина. Вибрион Эль-Тор к полимиксину не чувствителен, классический холерный вибрион – чувствителен;

• гемолитические свойства. Вибрион Эль-Тор лизирует эритроциты; классический холерный вибрион, как правило, нет (демонстрация);

• определение серовара холерного вибриона. Учесть разверну­тую реакцию агглютинации c сыворотками Инаба и Огава (демонстрация).

3. Изучить биопрепараты, используемые для диагностики, лечения и профилактики бактериальной дизентерии и холеры:

• люминесцирующая хо­лерная сыворотка для постановки реакции иммунофлюоресценции с целью выявления вибрионов;

• агглютинирующие холерные сыворотки Инаба и Огава (для постановки реакции агглютинации при идентифика­ции холерного вибриона);

• холерные фаги: классический (фаг С) и Эль-Тор. Использу­ются для фагодиагностики;

• поливалентный холерный бактериофаг для лечения и профилактики;

• холерная вакцина. Создано 3 вакцины против холеры (убитая Эль-Тор; холероген- анатоксин, обогащенный О-антигеном холерного вибриона для подкожных инъекций; холероген-анатоксин, обогащенный О-антигеном холерного вибриона таблетированный). Используются для специфи­ческой профилактики холеры.