Материал для исследования:кровь, моча, испражнения, пунктат костного мозга, скарификат розеол, ликвор, желчь, секционный материал и др.

Бактериологический метод

1 день.Посев крови на среду Раппопорт, испражнений, мочи и др. насреду Плоскирева, Эндо, висмут-сульфит агар ВСА) и среды накоп­ления (селенитовую, магниевую, тетратионатную, Кауфмана, Мюллера). Культивирование сутки при 37⁰ С.

2 день. Учет характера роста на среде Раппопорт (при наличии сальмонелл среда окрашивается в красный цвет в результате расщепления маннита или глюкозы; паратифозные бактерии вызывают газообразование). На средах Плоскирева, МакКонки или Эндо - бесцветные (лактозоотрицательные) колонии, на ВСА – черные (колонии сальмонелл па­ратифа А на ВСА окрашены в зеленый цвет, так как не образуют сероводород). Из типичных колоний готовят мазок, окрашивают по Граму и после микроскопии остаток колонии пересевают на среду Ресселя или Олькеницкого. Пересев на те же среды материал со сред обогащения при отсутствии на них типичных колоний.

3-й день. Учет характера роста на средах Ресселя или Олькеницкого, проверка чистоты выделенной культуры, пересев в среды «пестрого» ряда для изучения биохимических свойств, постановка ОРА со смесью сальмонеллезных О-сывороток, а затем с монорецепторными О- и Н-сыворотками с целью антигенной идентификации сальмонелл брюшного тифа и паратифов. Постановка развернутой РА, посев для определения фаголизабильности и фаговара.

4-й день. Учет изменений в средах «пестрого» ряда, результатов развернутой РА, фаголизабельности и фаговара. Формулировка ответа.

Серологический метод

Постановка ре­акции Видаля (развернутая РА) с ОН, О- брюшнотифозным, паратифозным А и паратифозным В диагностикумами, РНГА с эритроцитарными групповыми (А, В, С, Д, Е) и монорецепторными диагностикумами, ИФА с парными сыворотками крови больного в динамике заболевания с целью определения соответствующих антител и нарастания их титра в крови больного. Определение антител к Vi-антигену S.typhi в сыворотке крови брюшнотифозных бактерионосителей с помощью РНГА

а б

Рис. 14. а - кишечная палочка (E.coli ув. Х1350), б - возбудитель брюшного тифа (S.typhi, ув. Х630) в мазках из чистой культуры. Окраска по Граму. Грамотрицательные беспорядочно расположенные палочки средних размеров.

Копрокультуру выделяют путем посева фекалий на среду Плоскирева, Эндо, висмут-сульфит агар и среды накоп­ления (селенитовую, магниевую, тетратионатную, Кауфмана, Мюллера) с последующей 18 —24-часовой инкубацией при 37 °С.

На 2-й день на средах Плоскирева, МакКонки или Эндо вырастают бесцветные (лактозоотрицательные) колонии, а на висмут-сульфит-агаре – черные. Колонии сальмонелл па­ратифа А окрашены в зеленый цвет, так как не образуют сероводород. Из типичных колоний готовят мазок, окрашивают по Граму и после микроскопии остаток колонии пересевают на среду Ресселя или Олькеницкого. При отсутствии типичных колоний на те же среды засевают материал со среды обогащения.

На 3-й день исследования учитывают характер роста на среде Ресселя или Олькеницкого (окрашивание столбика среды Ресселя в синий цвет, среды Олькеницкого в желтый в результате ферментации глюкозы в анаэробных условиях; скошенная часть среды не изменена – отсутствие ферментации лактозы), готовят мазок для проверки чистоты выделенной культуры, выполняют пересев в среды «пестрого» ряда для изучения биохимических свойств (см. табл. 10), после чего

ставят ориентировочную, а потом развернутую РА. Ориентировочную РА ставят со смесью О-сывороток, включающей агглютинины к О-антигенам 2, 4, 7, 8, 9, 3-10. При отсутствии РА с этой смесью используют смесь монорецепторных О-сывороток к редким группам сальмонелл (антитела к антигенам 11, 13, 15, 19, 23 и т.д.) При получении положительных результатов культуру испытывают отдельно с каждой из О-сывороток, входящих в состав смеси. После этого культуру агглютинируют с Н-сыворотками 1 фазы (a, b, i, c, d, g, m) а потом 2 фазы (1,2; 1,5), устанавливая антигенную формулу выделенной сальмонеллы в соответствии со схемой Кауфмана-Уайта (таблица 9). Эта схема разработана на основании изучения у сальмонелл О и Н антигенов и применяется с целью антигенной идентификации патогенных сальмонелл.

Таблица 9. Антигенная структура сальмонелл (сокращенная схема Кауфмана-Уайта)

Группа	Серовар	О-антиген	Н-антиген
			Фаза 1	Фаза 2
А	Paratyphi A	1, 2, 12	a	-
B	Paratyphi B Typhi murium	1, 4, 5, 12 1, 4, 5, 12	b i	1, 2 1, 2
C	Paratyphi C Cholerae suis	6, 7, Vi 6, 7	c c	1, 5 1, 5
D	Typhi Enteritidis	9, 12, Vi 1, 9, 12.	d g, m	- -

На 4-й день от начала исследования учитывают изменения сред «пестрого» ряда (см. табл. 10), результаты развернутой РА и выдают ответ. Выделенные культуры подвергают фаготипированию, что позволяет установить источник и пути заражения.

Мочу, дуоденальное содержимое, соскоб розеол, сек­ционный материал с целью выделения тифо-паратифозных бактерий засевают на плот­ные среды (Эндо, Мак-Конки и т.п. в чашке Петри), а также в среды накоп­ления. При наличии характерного роста идентификация прово­дится по вышеописанной схеме.

Таблица 10. Биохимические свойства возбудителей брюшного тифа и паратифов

Биовар S.enterica	Ферментация					Продукция
	Лакто- зы	Глю- козы	Маль- тозы	Саха- розы	Ман- нита	Н2S	NH3	индо- ла
Typhi	-	К	К	-	К	+	-	-
Paratyphi A	-	КГ	КГ	-	КГ	-	-	-
Paratyphi В	-	КГ	КГ	-	КГ	+	+	-

Обозначения: (+) - наличие свойства, (-) - отсутствие свойства, К – образование кислоты, КГ – образование кислоты и газа.

Аналогично проводится исследование испражнений у перебо­левших брюшным тифом и паратифом лиц, а также у работников детс­ких учреждений, питания и водоснабжения с целью выявления бактерионосителей.

Серологическое исследование. Для серологической диагности­ки брюшного тифа и паратифов ставят ре­акцию Видаля (развернутая РА) с целью определения соответствующих антител в крови больного. Антитела к возбудителям брюшного тифа, парати­фов А и В обнаруживаются в сыворотке крови больных с 8— 10-го дня заболевания. Исследуемую сыворотку крови разводят двукратно в 6 параллельных рядах пробирок от 1:100 до 1: 1600 в объеме 1 мл, куда вносят по 2 капли ОН- и О- брюшнотифозного, паратифозного А и паратифозного В диагностикумов. О-диагностикумы получают кипячением или обработкой спиртом взвеси соот­ветствующих культур, ОН-диагностикумы - обработкой формалином. Для контроля антигена диагностикумы вносятся в той же дозе в 1 мл физиологического раствора, а для контроля сыворотки ис­пользуют сыворотку в разведении 1:100 без добавления диагностикумов.

О-антитела имеют диагностическое значение, они появляются в крови на второй неделе заболева­ния и исчезают к его концу, а Н-агглютинины нараста­ют к концу заболевания. и диагностической ценности не имеют. Н-антитела могут обнаруживаться также у переболевших и вакцинированных. Ряд брюшнотифозных вакцин вызывает также выработку Vi – и О антител. Диагностический титр О-антител в реакции Видаля у неиммунизированных лиц 1 :100, а при отсутствии типичной клинической картины - 1 :200. Однако титр антител у больных может быть ниже диагностического в связи с ранним назначением антибиотиков или наличием у больного вторичного иммунодефицита. Таким образом, отрицательная реакция Видаля не исключает тифопаратифозное заболевание. С другой стороны, повышенные титры О-антител могут быть обусловлены прививками. Поэтому при подозрении на брюшной тиф или паратифы целесообразно исследовать сыворотку крови как можно раньше (до появления антител), а затем в динамике (с интервалом 7-12 дней) для выявления нарастания титра антител более чем в 4 раза. Если сыворотка крови больного агглютинирует одновре­менно два или три вида диагностикумов, учитывают титр агглютинации: специфическая агглютинация происходит обычно с более высокими, а групповая — с более низкими разведениями сыворотки.

Более чувствительны РНГА с эритроцитарными групповыми (А, В, С, Д, Е) и монорецепторными диагностикумами, а также ИФА, которые ставят с парными сыворотками в динамике заболевания.

Vi-антитела чаще обнаруживаются у бактерионосителей сальмонелл брюш­ного тифа, т.к. Vi-антиген способствует длительной персистенции возбудителя в организме. При обследовании лиц, подозрительных на носительство брюшнотифозных палочек, применяется РНГА с эритроцитарным Vi-диагностикумом для определения соответствующих антител и их принадлеж­ности к классу IgG.