§ 6. Разрушение биологического материала азотной и серной кислотами

Все объявления

ЯндексДирект

Дать объявление

• Формалин В/с 37% технический

Формалин фас.канистры, бочки от 21р. Оптовым покупателям Подарки! Москва.

Адрес и телефон·  www.himi.ru

Метод разрушения биологического материала азотной исерной кислотамиявляется основным методом, применяемым ь химико-токсикологических лабораториях нашей страны.

В начале минерализацииконцентрированнаясерная кислотаиграет роль водоотнимающего средства. Ее роль как водоотнимающего средства усиливается с повышениемтемпературы. Благодаря водоотнимающему действию концентрированнаясерная кислотанарушает структуруклетокитканейбиологического материала. При повышениитемпературы(выше 110°С) иконцентрации(до 60—70 %)серной кислотыона проявляет окислительные свойства и разлагается с выделениемоксидасеры(IV).

Азотная кислота, находящаяся в смеси ссерной кислотой, вначалеминерализацииявляется слабымокислителем. Со временем частьазотной кислотыприокислениибиологического материала превращается воксиды азотаиазотистую кислоту, которые являются автокатализаторами дальнейшего более интенсивного процессаокисленияорганическихвеществазотной кислотой. С образованиемоксидов азотаиазотистой кислоты, а также с повышениемтемпературыазотная кислотапроявляет себя как сильныйокислитель.

В процессе нагревания биологического материала со смесью азотной и серной кислотпроисходит не только разрушение органическихвеществэтими кислотами, но и ряд побочных реакций, к числу которых относятся реакциисульфированияинитрованияорганических соединений.Нитрованиюисульфированиюв основном подвергаются фенильные группыаминокислот, образующихся пригидролизебелковыхвеществкислотами.Нитрованиеисульфированиеорганическихвеществпри разрушении биологического материала смесью азотной исерной кислотявляется нежелательным, так как нитро- и сульфосоединения довольно трудно разрушаются смесью этих кислот.

При разбавлении серной и азотной кислотводойстепеньнитрованияисульфированияорганических соединений этими кислотами значительно уменьшается. Поэтому разрушение биологического материала производится не концентрированными, а частично разбавленными азотной исерной кислотами.

В процессе разрушения биологического материала смесью азотной и серной кислотобразуется некоторое количество нитро-зилсерной кислоты HOSO₂ONO, которая мешает обнаружениюкатионовнекоторыхметалловв минерализатах.

В первой стадии минерализациипроисходит деструкция биологического материала азотной исерной кислотами, которая заканчивается за 30—40 мин (о деструкции см. § 25). В результате деструкции получается прозрачнаяжидкость(деструктат), имеющая желтоватую илибуруюокраску.

Во второй стадии минерализациипроисходит разрушение (окисление) органическихвеществ, находящихся в жидкой фазе (деструктате), полученной после деструкции биологического материала. Эта стадия разрушения более длительная, чем стадия деструкции.

Для окончательного разрушения органических веществ, находящихся в жидкой фазе, к ней при нагревании по каплям прибавляютазотную кислоту. Полное разрушение органическихвеществв жидкой фазе зависит от количества прибавляемойазотной кислоты. От прибавления больших количествазотной кислотыпроисходит обильное выделениеоксидов азота, выходящих из колбы и загрязняющихатмосферулаборатории. От прибавления в колбу недостаточных количествазотной кислотынаходящиеся в ней органическиевеществаобугливаются горячейсерной кислотой, о чем свидетельствует потемнениежидкостив колбе. При обугливании органическихвеществсерной кислотойизжидкостис выходящимигазамимогут улетучиваться соединениямышьякаиртути.

Разрушение биологического материала азотной и серной кислотамисчитается законченным тогда, когда после прекращения добавленияазотной кислоты(при нагревании колбы) будут выделяться белыепарысерной кислотыи не будет происходить почернение минерализата.

Полученный минерализат используют для обнаружения и количественного определения «металлических ядов». Однако обнаружению и количественному определению катионовнекоторыхметалловмешают азотная иазотистая кислоты, а такжеоксиды азота, находящиеся в минерализатах. В связи с этим минерализаты, полученные после разрушения биологического материала, подвергают денитрации.

Денитрация — процесс освобождения минерализатов от азотной, азотистой, нитрозилсерной кислотиоксидов азота. На первых этапах применения метода разрушения органическихвеществазотной исерной кислотамидля денитрации минерализатов применялся так называемый гидролизный метод. Этот метод основан на разбавлении минерализатовводойи на последующем нагревании полученныхжидкостей. При нагревании минерализатов, разбавленныхводой, улетучиваются азотная,азотистая кислотыиоксиды азота, анитрозилсерная кислотапри указанных условиях практически не улетучивается. Она постепенно разлагаетсяводой(гидролизуется).

Азотистая кислота, образовавшаяся при разложенииводойнитрозилсерной кислоты, улетучивается при нагревании. Для освобождения минерализатов от азотсодержащих кислот иоксидов азота(включая нитрозилсерную кислоту) с помощью этого метода требуется 15—17 ч рабочего времени.

Для денитрации минерализатов позднее были предложены мочевина,сульфит натрияи др. С помощьюмочевиныпроцесс денитрации минерализатов заканчивается за 3—5 мин (при 135— 145°С), а с помощьюсульфита натрия— за 10—15 мин (притемпературевыше 100°С).

В 1952 г. Ф. В. Зайковский предложил метод денитрации минерализатов формальдегидом. При взаимодействииформальдегидасазотной кислотой, которая почти всегда находится в минерализате, выделяетсяазот:

4HNO ₃+ 5НСНО ---> 2N₂+ 5СО₂+ 7Н₂О.

В результате взаимодействия азотистой кислотысформальдегидомвыделяютсяазот,оксид азота(II),оксид углерода(IV) ивода:

4HNO ₂+ 2НСНО ---> Ν₂+ 2ΝΟ + 2СО₂+ 4Н₂О.

Оксид азота(II) окисляетсякислородомвоздухадооксида азота(IV), который при взаимодействии сводойдаетазотную иазотистую кислоты:

ΝΟ + Ο — ΝΟ ₂2ΝΟ₂+ Н₂О ---> ΗΝΟ₂+ ΗΝΟ₃

Образовавшиеся при этом азотная и азотистая кислотыреагируют сформальдегидом, как указано выше.

Нитрозилсерная кислотапри нагревании сводойразлагается. Образовавшаяся при этомазотистая кислотареагирует сформальдегидом, как указано выше.

Для денитрации минерализатов, полученных при разрушении биологического материала азотной и серной кислотами, к ним прибавляют 10—15 млводы. В этужидкость, нагретую до 110— 130°С, осторожно по каплям прибавляютформалин(40 %-йрастворформальдегида). При этом наблюдается обильное выделение пузырьковгаза(Ν₂и NO), иногда имеющего оранжево-бурую окраску (ΝΟ₂). Процесс денитрации минерализатовформалиномзаканчивается за 1—2 мин. Для этой цели требуется от нескольких капель до нескольких миллилитровформалина. Избытокформальдегида, не вступившего в реакцию с азотной иазотистой кислотами, удаляют нагреваниемжидкостив течение 5—10 мин.

Для проверки полноты денитрации минерализатов проводят реакцию с растворомдифениламина(0,5 гдифениламинарастворяют в 100 г концентрированнойсерной кислотыи прибавляют 20 мл дистиллированной воды). На предметное стекло или на фарфоровую пластинку с углублением наносят 1—2 капли мине-рализата, к которому прибавляют 1 каплю указанного вышерастворадифенламина всерной кислоте. При наличии азотной,азотистой кислотилиоксидов азотав минерализате появляется синяя окраска. Эта реакция основана наокислениидифениламинаазотной кислотойи продуктами ее разложения. Вначале приокислениидифениламинаобразуется бесцветный дифенилбензи-дин, приокислениикоторого образуется соединение, имеющее синюю окраску:

Денитрация считается оконченной тогда, когда реакция минерализата с растворомдифениламинабудет отрицательной. Если от прибавлениярастворадифениламинак минерализату он окрашивается в синий цвет, то денитрацию проводят повторно.

Выполнение минерализации. В колбу Кьельдаля вместимостью 500—800 мл вносят 100 г измельченного биологического материала, прибавляют 75 мл смеси, состоящей из равных объемов концентрированных азотной исерной кислотиводы. Колбу с содержимым в вертикальном положении закрепляют в штативе так, чтобы дно ее находилось над асбестированной сеткой на расстоянии 1—2 см. Над колбой Кьельдаля в штативе закрепляют делительную воронку, в которой содержится концентрированнаяазотная кислота, разбавленная равным объемомводы. После этого начинают осторожно нагревать колбу. В течение 30—40 мин происходит деструкция биологического материала. При этом прозрачнаяжидкостьв колбе приобретает желтую илибуруюокраску. Затем колбу Кьельдаля с содержимым опускают на асбестированную сетку и усиливают нагревание. Для разрушения органическихвеществ, находящихся в колбе, из капельной воронки по каплям прибавляют концентрированнуюазотную кислоту, разбавленную равным объемомводы. Прибавлениеазотной кислотырегулируют так, чтобы из колбы не выделялисьбурыепарыоксидов азота.Минерализациясчитается законченной тогда, когда прозрачнаяжидкость(минерализат) при нагревании без добавленияазотной кислотыперестанет темнеть, а наджидкостьюбудут выделяться белыепарысерной кислоты.

Полученный минерализат охлаждают, прибавляют 10—15 мл дистиллированной водыи нагревают до 110—130°С, а затем осторожно по каплям (избегая избытка) прибавляютформалин. При этом отмечается обильное выделениебурых(иногда оранжевых)паров. После окончания выделения этихпаровжидкостьеще нагревают 5—10 мин, а затем 1—2 капли охлажденнойжидкости(минерализата) наносят на предметное стекло или на фарфоровую пластинку и прибавляют каплюрастворадифениламинавсерной кислоте. Отрицательная реакция минерализата сдифениламиномна азотную,азотистую кислоты, а также наоксиды азотауказывает на окончание процесса денитрации. При положительной реакции минерализата сдифениламиномденитрацию проводят повторно.

Минерализат, содержащий большинство катионовметаллов, будет бесцветным. В минерализате могут бытькатионымедиихрома. В этом случае минерализат будет окрашен соответственно в синий или зеленый цвет. Если в биологическом материале содержалисьбарийисвинец, то в минерализате будут осадки сульфатов этихметаллов.

Методы обнаружения и количественного определения катионовв минерализатах описаны в последующих разделах этой главы.

Метод минерализациибиологического материала азотной исерной кислотамиимеет ряд достоинств.Минерализацияэтим методом происходит быстрее, чем методом разрушения биологического материалахлоратом калияисоляной кислотой, а также некоторыми другими методами. При использовании методаминерализациибиологического материала азотной исерной кислотамиполучаются относительно небольшие объемы минерализатов. Это обстоятельство оказывает влияние на чувствительность методов обнаружения «металлических ядов» в минерализатах.

Однако этот метод непригоден для изолирования ртутииз биологического материала, так как значительные количества ее улетучиваются при нагревании биологического материала с серной иазотной кислотами. Метод изолированияртутииз биологического материала описан ниже (см. гл. VI, § 25).