§ 5. Очистка вытяжек из биологического материала от примесей

Вытяжки, полученные настаиванием биологического материала с подкисленной водойили с подкисленнымэтиловым спиртом, всегда содержат определенное количество примесей белковыхвеществ,аминокислот,липидови других соединений, мешающих обнаружению и количественному определению ядовитыхвеществ, находящихся в этих вытяжках. В связи с этим вытяжки из биологического материала подвергают очистке от примесей.

Известно несколько способов очистки вытяжек. Для этой цели применяется фильтрование,центрифугирование,осаждение, экстракция и ряд физико-химических методов.

Фильтрование и центрифугирование.Для очистки вытяжек от механических загрязнений (мелких частичек биологического материала) применяютфильтрование. Однако через поры фильтров могут проходить более мелкие частицы твердыхвеществ, размер которых меньше диаметра пор фильтров. Кроме этого, материалом фильтров могут адсорбироваться определенные количества ядовитыхвеществ, которые выделяют из биологического материала. Учитывая указанные выше недостаткифильтрования, как метода очистки вытяжек от примесей, для этой цели применяют методцентрифугирования.

Осаждение ггримесей.Примеси, переходящие из биологического материала в вытяжки, которые проходят через поры фильтров и не осаждаются прицентрифугировании, могут осаждаться соответствующими реактивами. Ряд реактивов применяют не только для очистки вытяжек из биологического материала, но и дляосаждениябелковых и другихвеществиз крови. К числу таких реактивов относятся: трихлоруксусная, вольфрамовая, ме-тафосфорная кислоты; некоторые гетерополикислоты (фосфорно-вольфрамовая, фосфорно-молибденовая) и другиевещества. Причем фосфорно-вольфрамовая и фосфорно-молибденовая кислоты осаждаютбелкиипептиды, атрихлоруксусная кислотаосаждаетбелки, но не осаждаетпептиды.

Ряд белковых веществосаждается под влияниемтемпературы. При повышениитемпературыприблизительно до 40 °Срастворимостьбольшинствабелковвозрастает (из этого правила имеются исключения). При дальнейшем повышениитемпературыпроисходитденатурациябелковыхвеществ, понижается ихрастворимость, в результате чего они выпадают в осадок. Такой способ очистки вытяжек применяется при выделенииалкалоидовиз биологического материала по методу Стаса — Отто.

Как отмечалось выше, от прибавления этилового и метилового спиртов,ацетонаи других органическихрастворителей, смешивающихся сводой, понижаетсярастворимостьбелковыхвеществ. В результате этого они могут выпадать в осадок.

Одним из эффективных методов освобождения вытяжек из биологического материала от белковых веществи других примесей являетсявысаливание. Эффективностьвысаливаниязависит отконцентрациии природыэлектролитов, прибавляемых крастворамили вытяжкам из биологического материала.

При низких концентрацияхнейтральныеэлектролитыповышаютрастворимостьмногих белковыхвеществ. Этот эффект не зависит от природы применяемойсоли, но зависит от ееконцентрациии зарядаионов, входящих в составсоли.Соли, содержащие двухвалентныеионы, повышаютрастворимостьбелковлучше, чемсоли, состоящие из одновалентныхионов. Повышениерастворимостибелковыхвеществпод влиянием низкихконцентрацийэлектролитовобъясняется изменением степенидиссоциацииионизированных (карбоксильных, фенольных, сульфгидрильных) группбелков.

С повышением концентрациисолей, прибавляемых к вытяжкам,растворимостьбелковпонижается, а при дальнейшем прибавлении этихсолейбелковыевеществамогут выпадать в осадок.

По даннымлитературы,высаливаниеявляется одним из эффективных методовосажденияпримесей из вытяжек, полученных при настаивании гнилостного биологического материала с подкисленнойводой.

Высаливаниеиспользуется не только для повышения или понижениярастворимостибелковыхвеществ. В химико-токсикологическом анализевысаливаниеможет применяться и для повышения степени экстракции многих ядовитыхвеществиз водныхрастворов(см. гл. III, § 1).

Осаждениебелковыхвеществиз вытяжек можно производить путем изменения рН среды. При рН, соответствующемизоэлектрической точкебелка, он не несет суммарного заряда. Поэтому при указанном рН между соседнимимолекуламибелкаотсутствует электростатическое отталкивание. В результате этого происходит слипаниемолекулбелкаи выпадение его в осадок. При значениях рН выше или нижеизоэлектрической точкибелкаегомолекулыимеют суммарный заряд одного знака, и поэтому выпадениебелкав осадок не происходит.

Все перечисленные выше методы осажденияпримесей до некоторой степени позволяют освободить вытяжки из биологического материала от белковых и другихвеществ. С помощью метода, основанного наосаждениипримесей соответствующими реактивами (фосфорно-вольфрамовой, фосфорно-молибденовой кислотами и др.), можно очистить вытяжки не только от белковыхвеществ, но и от некоторых других азотсодержащих соединений. Однако некоторые примеси из вытяжек невозможно осадить с помощью перечисленных выше методов.

Необходимо отметить, что методы очистки вытяжек, основанные на осаждениипримесей, имеют и некоторые недостатки. Осадки примесей могут адсорбировать на своей поверхности отдельные, подлежащие исследованию, токсическиевещества.Адсорбциятоксическихвеществосадками примесей может быть одной из причин потерь исследуемыхвеществв ходе химико-токсикологического анализа.

Экстракция примесей из вытяжек. В химико-токсикологическом анализе для очистки вытяжек из биологического материала метод экстракции применяется более часто, чем другие методы. При помощи метода экстракции можно очистить вытяжки от липидов,аминокислот, продуктов ихдекарбоксилированияидезаминирования, а также от ряда других примесей. Экстракция примесей из вытяжек успешно проходит только тогда, когда правильно выбран несмешивающийся сводойорганическийрастворительи установлено соответствующее значение рН среды, из которой извлекают примеси. При неправильно выбранном рН среды совместно с примесями может экстрагироваться и определенное количество исследуемоговещества. Экстракция примесей должна производиться при таком значении рН среды, при котором не экстрагируются исследуемыевещества, находящиеся в вытяжках.

Применение физико-химических методов для очистки вытяжек. В последнее время в химико-токсикологическом анализе для очистки вытяжек из биологического материала от примесей внедряются некоторые физико-химические методы. Для этой цели применяются методы ионообменной хроматографии, гель-хроматографии, молекулярной адсорбционнойхроматографиина колонках и др. Методыхроматографии на бумаге, в тонких слоях сорбентов, а также методыэлектрофорезав основном используются для обнаружения токсическихвеществ, находящихся в вытяжках из биологического материала. В ряде случаев эти методы пригодны для обнаружения исследуемыхвеществв вытяжках без предварительной очистки их от примесей.