§ 3. Метод микродиффузии
Метод микродиффузии широко используется в биохимических и некоторых токсикологических лабораториях для обнаружения химическихсоединений, имеющих большую упругостьпаров. Этот метод применяется в судебно-химических лабораториях в зарубежных странах. В судебно-химических лабораториях СССР этот метод не нашел широкого применения. В нашей стране рекомендован к применению только агар-диффузионный метод обнаружения фосфорорганическихпестицидовв трупном материале, являющийся одной из модификаций метода микродиффузии.
Внедрение метода микродиффузии в практику судебно-химических лабораторий может облегчить выполнение ряда экспертиз, связанных с отравлениями некоторыми ядами.
Для обнаружения исследуемых веществметодом микродиффузии применяютчашкиКонвея или подобные имсосуды, в которых летучиевеществаиз исследуемых объектов сначала переходят в пространство прибора, а затем в соответствующийрастворительили врастворреактивов, реагирующих с определяемымивеществами.
Метод микродиффузии имеет ряд достоинств. Он позволяет обнаружить летучие вещества, содержащиеся в небольших количествах исследуемых объектов. При использовании этого метода не образуетсяпена(что возможно приперегонкелетучих ядовитыхвеществс водяным паром), определяемыевеществане подвергаются сильному разбавлению и г. д.
Скорость диффузиизависит от упругостипараисследуемоговещества, объема пробы,температуры, состава поглощающихжидкостейи т. д. На скорость перехода отдельных летучихвеществиз исследуемых объектов в пространство прибора для микродиффузии влияют некоторыеэлектролиты. Так, например, прибавление насыщенногорастворакарбоната калияк крови, моче и гомогенатамтканей, содержащихэтиловый спирт, ускоряет переход этогоспиртав пространство прибора. Для ускорения перехода других соединений из исследуемых объектов в пространство прибора прибавляют кислоты,щелочии др.
Прибор для микродиффузии (рис. 1) представляет собой небольшой круглый толстостенный сосуд1 из стекла илипластмассы(наружный диаметр 60—70 мм, высота 10 мм). Внутри этогососударасположен второй круглыйсосуд2 меньшего размера (диаметр 30—35 мм, высота 5 мм). Таким образом, в приборе для микродиффузии имеется внутренняя круговая 3 и наружная кольцевая 4 камеры. Верхний край наружной камеры должен пришлифовываться так, чтобы к нему плотно прилегала крышка 5.
Для создания герметичности в приборе края наружной камеры слегка смазывают вазелиномили силиконовой смазкой и плотно прижимают крышку.
Исследуемые объекты вносят в наружную кольцевую камеру, а поглощающую жидкость— во внутреннюю камеру. К. исследуемым объектам, находящимся в наружной камере прибора, на расстоянии 2—3 см помещаютрастворвещества, способствующего переходу исследуемого соединения из объекта в пространство прибора. Затем прибор плотно закрывают крышкой и слегка наклоняют его для смешивания исследуемого объекта ираствора, способствующего переходу исследуемоговеществав пространство прибора. После этого прибор оставляют на определенное время, необходимое длядиффузии. После окончаниядиффузииопределяют исследуемоевеществовжидкости, находящейся во внутренней камере.
Методика обнаружения отдельных летучих соединений с помощью метода микродиффузии описана ниже.
Обнаружение формальдегида. В наружную камеру прибора для микродиффузии вносят 3 мл крови или мочи, или 1 г гомогенататканей. Затем в ту же камеру вносят 3—4 капли 10 %-горастворасерной кислоты. Во внутреннюю камеру прибора вносят 3,3 мл 0,15 Μрастворагидросульфита илисульфита натрия. Прибор плотно закрывают крышкой и оставляют на 4 ч при комнатнойтемпературе. После этогожидкость, находящуюся во внутренней камере прибора, исследуют на наличиеформальдегида.
Из внутренней камеры прибора берут1 млжидкости, которую вносят в пробирку, и прибавляют 9 млводы. Пробирку охлаждают ледянойводой, а затем прибавляют 0,2 мл свежеприготовленного 0,5%-горастворахромотроповой кислотыи 4 мл концентрированнойсерной кислоты.Жидкостьхорошо взбалтывают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин, а затем охлаждают. О наличииформальдегидав исследуемой пробе свидетельствует появление розовой или фиолетовой окраски.
Обнаружение альдегида уксуснойкислоты. Наружную и внутреннюю камеры прибора заполняют так, как и при обнаруженииформальдегидаметодом микродиффузии. Время микродиффузии 4 ч.
Через 4 ч в пробирку вносят 1 мл жидкости, взятой из внутренней камеры прибора, прибавляют 9 млводы, 1 каплю 4 %-горастворасульфата меди, 6 мл концентрированнойсерной кислотыи 0,2 мл 1 %-гораствораn -гидроксидифенила в 0,5 н.растворегидроксида натрия. После прибавления каждого реактиважидкостьв пробирке хорошо взбалтывают, затем пробирку нагревают в течение 1,5 мин на кипящей водяной бане и охлаждают. При наличииальдегида уксуснойкислоты в исследуемых объектахжидкостьприобретает фиолетовую окраску. Такую же окраскудаетиформальдегид.
Обнаружение ацетона.Заполнение наружной и внутренней камеры производят так, как при исследованииформальдегида. Время микродиффузии 4 ч.
После окончания микродиффузии из внутренней камеры прибора берут1 млжидкостии переносят ее в пробирку, в которую прибавляют 9 млводы, 4 мл 40 %-горастворагидроксида натрия, 1 мл 20 %-го свежеприготовленногорастворасалицилового альдегидавэтиловом спирте. Пробирку в течение трех минут нагревают на водяной бане (при 50—60 °С), а затем охлаждают до комнатнойтемпературы. При наличииацетонав пробе появляется красная окраска.
Обнаружение метилового спирта.Этот метод основан наокисленииметилового спиртадоформальдегида. При взаимодействииформальдегидасхромотроповой кислотойпоявляется фиолетовая окраска (см. гл.IV, § 7).
В наружную камеру прибора для микродиффузии вносят 1 мл крови или мочи либо 1 г гомогената ткани. Затем в наружную камеру вносят 1 мл насыщенногорастворакарбоната калия. Во внутреннюю камеру прибора вносят 3 мл 10%-горастворасерной кислоты. Прибор закрывают крышкой и оставляют на 3 ч. При исследовании гомогенататканивремядиффузииувеличивается до пяти часов.
К 1 мл раствора, взятого из внутренней камеры, прибавляют ] каплю 5%-гораствораперманганата калияи оставляют на 10 мин, а затем прибавляют 1—2 капли насыщенногорастворагидросульфита илисульфита натрия. После исчезновения окраскиперманганата калиякжидкостиприбавляют 0,2 мл 0,5 %-горастворахромотроповой кислотыв концентрированнойсерной кислоте.Жидкостьв пробирке охлаждают в ледянойводе, а затем прибавляют 4 мл концентрированнойсерной кислотыи нагревают пробирку на кипящей водяной бане в течение 15 мин.
Появление красной или фиолетовой окраски жидкостиуказывает на наличиеметилового спиртав исследуемой пробе. Эту пробу выполняют тогда, когда в исследуемом объекте отсутствуетформальдегид.
Определение этилового спирта.Во внешнюю камеру прибора для микродиффузии вносят 0,8 мл крови или мочи либо 4 мл гомогенататкании 1 мл насыщенногорастворакарбоната калия. Во внутреннюю камеру вносят 2 млрастворадихромата калиявсерной кислоте.Сосудплотно закрывают крышкой и оставляют на 3 ч при комнатнойтемпературе. При исследовании гомогенататканисосудоставляют на 4 ч при 37 °С или же на 12 ч при комнатнойтемпературе. Появление зеленой или зеленовато-оранжевой окраскижидкостиво внутренней камере указывает на наличиеэтилового спиртав исследуемом объекте. Эта проба не специфична наэтиловый спирт. Подобную окраскудаюти другиевещества, окисляющиесядихроматом калия.
Приготовление раствора дихромата калия (см. Приложение 1, реактив 13).
Обнаружение сульфидов. В наружную камеру прибора для микродиффузии вносят 2—4 мл крови или мочи, или же 1 г гомогенататкани. Затем в ту же камеру вносят 3—4 капли 10 %-горастворасерной кислоты. Во внутреннюю камеру прибора вносят 3,3 мл 0,1 н.растворагидроксида натрия. Прибор плотно закрывают крышкой и оставляют на 3—4 ч при комнатнойтемпературе. Затем из внутренней камерыберут1 млжидкости, к которой прибавляют 1 млрастворанитратависмутавуксусной кислотеи 3 млводы. При наличии сульфидов в исследуемых объектах появляется коричнево-черная окраска или такого же цвета осадоксульфида висмута.
Приготовление раствора нитрата висмута (см. Приложение 1, реактив 25).
Обнаружение фенолов. Наружную и внутреннюю камеры прибора для микродиффузии заполняют так, как и при исследовании сульфидов. Через 3—4 ч определяют наличиефенолов.
К 1 мл жидкости, взятой из внутренней камеры прибора, прибавляют 2—3 мл 10 %-горастворагидроксида натрияи 0,5 мл фенолового реактива Фолина-Чиокальто, разбавленноговодой(1:3). При наличиифеноловпоявляется синяя окраска.
Приготовление реактива (см. Приложение 1, реактив 43).
Обнаружение цианидов. В наружную камеру прибора для микродиффузии вносят 2—4 мл крови или мочи, или же 1 г гомогенататкани. Затем в ту же камеру вносят 3—4 капли 10%-горастворасерной кислоты. Во внутреннюю камеру прибора вносят 3,3 мл 0,1 н.растворагидроксида натрия. Прибор плотно закрывают крышкой и оставляют на 3—4 ч при комнатнойтемпературе. Затем из внутренней камеры прибораберут1 млжидкости, к которой прибавляют 1 мл 0,1 н.растворагидроксида натрия, 2 мл 1 н.растворадвузамещенногофосфата натрияи 1 мл 0,25 %-горастворахлораминаТ.Жидкостьвзбалтывают и через 2—3 мин прибавляют 3 мл реактива, содержащегобарбитуровую кислотуипиридин. Смесь взбалтывают и оставляют на 10 мин. Появление красной окраски указывает на наличиецианидовв исследуемойжидкости.
Приготовление реактива (см. Приложение 1, реактив 1).
Приготовление свежеперегнанного пиридина (см. Приложение 1, реактив 27).
Определение оксида углерода (II). Во внешнюю камеру прибора вносят 1 мл крови и 1 мл 10 %-горастворасерной кислоты. Во внутреннюю камеру помещают 2 мл 0,1 %-горастворахлоридапалладияв 0,1 н.растворесоляной кислоты. Прибор плотно закрывают крышкой и оставляют на 1 ч при комнатнойтемпературе. При наличииоксида углерода(II) в крови во внутренней камере появляется серебристая пленка металлическогопалладия:
СО + PdCl 2+ Н2О ---> Pd + 2НС1 + СО2