2. HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, закодовані в DR, DQ і DP сублокусах

HLA-D локусу. Деякі з HLA-D антигенів не кодуються в одному

специфічному генному кластері, а є продуктом одночасного впли-

ву (міксингу) генів, локалізованих у різних кластерів.

У складі D локусу виділяють також 3 малі сублокуси: HLA-DX, HLA-

DN (колишній DZ) і HLA-DO:

1. HLA-DX кодує інформацію про а і b ланки НІА-рецепторів.

2. Dn і do локуси розміщені між dp і dq ділянками. Dn і do

містять по одному гену, які вважаються на сьогодні псевдогена-

ми, оскільки їх функцію поки що не вдалося вияснити.

//|Pp|dq |drhc2|BdC4Af210hAlC4b| 21-онвн tnFojTnFpHв[ с | а

Центромера ν „., ^ J ч, ^ J ^V ' ' γ ^J

Клас II Клас III Клас I

Схематична карта короткого плеча 6-ї хромосоми людини (голо-

вний комплекс генів сумісності тканин). Гени імунної відповіді (Іг-гени)

розташовані в HLA-D ділянці, яка містить DP, DO і DR локуси. Не існує

одного локусу для кожного з компонентів HLA-молекули. Кілька локусів

співкодують а і β ланки антигенів кожного класу. Гени TNF розміщені

між генами І і III класів (розміри генетичних локусів і проміжків між

ними на схемі не відповідають реальним):

— DP — декілька α і β ланок антигенів II класу;

— DO — декілька α ι β ланок антигенів II класу;

— DR — декілька α ί β ланок антигенів II класу;

— 21-ОН — 21 гідроксилаза системи цитохрому Р-450;

— Bf — фактор В системи комплементу;

— С2 — компонент 2 системи комплементу;

— С4 — компонент 4 системи комплементу;

— TNF — фактор некрозу пухлин;

— В — близько 50 алелів, які кодують молекули І класу;

— С — близько 8 алелів, які кодують молекули І класу;

— А — близько 20 алелів, які кодують молекули І класу.

ПЕНЗИ €ЖКЖ

ТТГХТ—ГЯ I G I F

Схематичне зображення ділянки 6-ї хромосоми, яка містить гени І

класу головного комплексу гістосумісності. Саме гени цього класу ма-

ють вирішальне значення для відторгнення чи приживлення алотранс-

плантата.

І ί — псевдоген;

І І — ген, який експресується (реалізує свою інформацію в антигенах).

Буквами латинського алфавіту позначені антигенні локуси.

Класифікація НІА за ВООЗ (1998). Більшість HLA-генів вис око полі-

морфні, тобто в кожному HLA-локусі можлива наявність значного чис-

ла алелів. Зокрема, ідентифіковано 50 алелів в НІА-А локусі, у DR, Cw,

DQ і DP локусах — 20, 34, 9 і 6 відповідно, ще 97 і 26 — у В і D локусах,

по 4 — в Ε та С. Кожен локус містить 2 гени — по 1 від батька і від

матері. Таким чином, кількість можливих комбінацій, обчислених лише

на підставі вже вивчених генів астрономічно велика — 50 x 20 x 34 x 9

x 6 x 97 x 26 x 4 x 4. Таке генетичне розмаїття повністю унеможлив-

лює підбір пари "донор-реципієнт" з ідентичним HLA.

Ці алелі розподіляються між 23 серологічними типами у HLA-А

50 — у HLA-В, 8 типами — у HLA-C. Назва одного серологічного типу

HLA складається з літери, що означає генний локус, та номера типу. У

сучасній номенклатурі вона використовується лише для вирізнення під-

типів Bw4 та Bw6 серед інших НLA-В-типів та для алелів локусу С, щоб

не плутати їх з генами факторів комплементу С2 та С4. Назва алеля

складається з літери, що означає генний локус, і з номера алеля (обид-

ва розділені позначкою ").

У HLA-D ділянці, особливо — у HLA-DR, розміщені по два-три гени,

кожен з яких кодує функціональну ділянку β-ланки. Це забезпечує

можливість експресії більше ніж двох алельних форм кожної DR моле-

кули. Така гібридизація веде до формування HLA-D молекул.

Ще більшою є кількість алелів, визначених молекулярно-генетич-

ним методом (поки що не затверджена у класифікації ВООЗ).

Таким чином, за допомогою молекулярно-генетичного методу ви-

являється значно більша різноманітність HLA, що дозволяє поліпшити

якість селекції донорських органів.

НІА-гени кодомінантш (тобто ген, успадкований від батька, і ген, ус-

падкований від матері, — рівнозначні) і при експресії проявляються всі.

Коли індивідуум гетерозиготний за окремими локусами (випадки А і Б на

рисунку), то обидва антигени експресуються і присутні у тканинах. На

противагу цьому, у гомозигот (гени, локалізовані в обох алелях, ідентичні

— випадок В) у тканинах присутній лише один антиген з такого локусу.

Як правило, на кожній клітині людини експресується більше 10 рі-

зних молекул-продуктів DR, DO і DP генів. Це значно збільшує кіль-

кість структур, які можуть виступати в ролі антигенів у процесі НІА-

рестрикції.

Схема представлення кодомінаитних апелів.

У HLA-комплексі 6-ї хромосоми кожен ген кодомінантний при експресії. Ось чому в

кожного індивідуума можуть бути представлені різні алелі у відповідних локусах двох

ниток хромосом. Обидва алелі в такому випадку експресуються. У прикладі А буде

спостерігатися експресія всіх чотирьох генів у молекулі HLA, у Б- 3 генів, у а - лише 2.

Гаплотипом називається набір алелів, представлених на одній нитці ДНК. Наприклад,

гаплотип хромосоми А (6-1) представлений у хромосомі Б (6-І), а також в обох нитках

хромосоми В.

Серед НІА-молекул, які кодуються МНС-структурами, виділяють 2

класи. НІА-А, HLA-B і Н1А-С молекули належать до антигенів І класу,

HIA-D, HLA-DP і HLA-DQ — до II. Кожен із класів антигенів експресу-

ється на певних типах клітин. Молекули І класу представлені на всіх

без винятку ядерних клітинах організму (у мишей аналогічний за фун-

кцією Н-2 МНС-антиген присутній у тому числі й на еритроцитах).

Антигени II класу експресуються на поверхні деяких імунокомпетент-

них клітин: антигенопрезентуючих (включаючи макрофаги), активова-

них Т-клітинах і частині В-лімфоцитів.

Антигени І і II класів складаються з 2 поліпептидних ланцюгів, α і β,

з'єднаних між собою нековалентними зв'язками. До складу кожного з

ланцюгів входять 90 % білків і 10 % вуглеводів.

Антигени І класу містять:

— α-ланцюг, який має 3 домени, зафіксовані до клітинної мембра-

ни;

— β-ланцюг, який є β₂-ΜίκροΓΛθ6γΛΪΗθΜ, тобто належить до β-глобу-

лінів сироватки крові.

Антигени II класу містять:

— α-ланцюг, який має 2 домени {a_t і aj, зафіксовані до клітинної

мембрани;

— β-ланцюг, який також складається з 2 доменів (β, і β₂).

Обидва ланцюги кодуються генами HLA-D ділянки. Більшість НІА—

епітопів {тобто антигенних ділянок) розміщена у β-ланці.

У кожній клітині є протеосомні комплекси, які забезпечують утво-

рення пептидів з цитоплазматичних білків. Вказані пептиди потрапля-

ють у пептидозв'язувальну борозну (кишеню Беркмана), де і викону-

ють функцію НІА-молекул І класу. У випадку мутації змінюються хара-

ктеристики пептиду, що веде до знищення мутованої клітини імунними

механізмами. Експресія (синтез) НІА-молекул на поверхні клітини не-

однакова, тобто може бути вираженою більшою чи меншою мірою.

Так, інтерферон посилює цю експресію, а простагландин Ε — послаб-

лює. Від інтенсивності експресії залежить сила імунної відповіді. HLA-I

представлені на всіх клітинах організму. HLA-I виконують роль рецеп-

торів для гормонів (наприклад, інсуліну), ростових факторів, кодують

статеву поведінку у тварин, а, можливо, і у людини. Цікаво, що запах

людей і тварин теж кодується молекулами HLA-I.

HLA-II молекули представлені переважно на антигенопрезентую-

чих клітинах. Проте після стимуляції цитокінами вони з'являються та-

кож на Т-хелперах-1, ендотеліальних і дендритних клітинах. На відміну

від HLA-I структур, вони утворюються за участю лізосомальних ферме-

нтів.

Молекули як І, так і II класів контролюють імунну відповідь за ра-

хунок процесу, який відомий під назвою НІА-рестрикція (обмеження).

Антигени II класу беруть участь у процесі презентації антигену макро-

фагами Т-хелперові, а також взаємодії Т- і В-лімфоцитів. Обидва класи

антигенів задіяні у процесі сенсибілізації при клітинноопосередкова-

ній цитотоксичності (клітинно-опосередкований цитоліз), яка реалізу-

ється Т-цитотоксичними лімфоцитами.

На антигенопрезентуючій клітині представлені антигени обох класів:

- HLA-I рестрикція: антигени 1 класу реагують з CD8 молекулами

попередників Т-ефекторів. Таким чином, Т-ефектори розпізна-

ють інформацію про антиген лише у комплексі з ΗLA-молеку-

лою І типу. Найчастіше проявляється щодо інфікованих віруса-

ми клітин;

- НІА-ІІ рестрикція: антигени II класу реагують із CD4 молекула-

ми Т-хелперів. Т-хелпери розпізнають інформацію про антиген

лише у комплексі з HLA-молекулою II типу.

Феномен НІА-рестрикції не задіяний ні при надгострому відторг-

ненні трансплантата, ні при багатьох типах пухлин — ці процеси опо-

середковані антитілами. Він також відсутній в ефекторній фазі гостро-

го чи хронічного відторгнення трансплантата.

HLA-антигени І і II типів також слугують мішенями при імунній

відповіді. НІА-алоантигени розпізнаються Т-цитотоксичними лімфоци-

тами при відторгненні трансплантата. НІА-А і НІА-В антигени І класу

і HLA-DR антигени II класу визначаються як головні трансплантаційні

антигени, оскільки саме вони є найважливішими структурами, які роз-

пізнаються імунною системою господаря при відторгненні трансплан-

тата. Вираження реакції клітинної цитотоксичності в цьому випадку

корелює з інтенсивністю процесу відторгнення.

НІА-антигени II класу відіграють принципову роль у реакції транс-

плантат проти господаря, наприклад після мієлотрансплантації.

Для ідентифікації НІА-антигенів І і II класів застосовується лімфо-

цитотоксичний тест, а для НІА II класу — ще й реакція змішаних

культур лімфоцитів. Для визначення DR антигенів використовують

також серологічні реакції.

Значно більшу інформацію можна отримати при визначенні не НІА-

антигенів (продуктів генетичної інформації), а самих генів на коротко-

му плечі 6-ї хромосоми. При цьому застосовують спеціальні ампліфіка-

ційні тести (ДНК-генотипування). Зрозуміло, що цей метод, маючи вищу

точність, значно дорожчий і трудомісткіший. Його застосування ви-

правдане при пересадженні кісткового мозку, а також для повторного

пересадження після відторгнення трансплантата, підібраного методом

серотипування.

Вважається, що специфічні гени імунної відповіді (Ir-immune response

genes) розміщені в HIA-D ділянці — здебільшого у DR, менше — у DP

і DO локусах. Проте, якщо у тварин ці гени визначені й конкретно

картовані, то щодо Ir-комплексу ЛЮДИНИ поки що існують певні сумні-

ви. Значне число дослідників уявляє собі його роботу як інтегральну

функцію кількох різних структур, причому лише частина з них коду-

ється генами HIA-D ділянки.

HLA-антигени III класу

Деякі локуси 6-ї хромосоми, що кодують синтез певних компонен-

тів системи комплементу (С2, С4а, С4Ь і фактора В — білка, що бере

участь в альтернативному шляху активації комплементу), фактори нек-

розу пухлин α і β, а також два типи гідроксилаз об'єднують у комплекс

III класу. Ці стуктури не мають відношення до сумісності тканин, не

задіяні у процесах HLA-рестрикції і процесах відторгнення трансплан-

татів.

HSP70 — білки теплового шоку, які з'являються на поверхні клітин

при її ушкодженні фізичними факторами (зміна рН, осмолярності, те-

мператури), і фактори некрозу пухлин також кодуються в HLA III.

КЛІНІЧНА ТРАНСПЛАНТАЦІЙНА ІМУНОЛОГІЯ

Основне завдання клінічної трансплантаційної імунології на доопе-

раційному етапі — селекція максимально сумісної за HLA- антигенами

пари "донор-реципієнт".

А. Оцінка сумісності донор-реципієнт:

1. Сумісність груп крові за системою АБО.

2. Типування тканин шляхом визначення HLA-антигенів.

3. Виявлення передг/снуючих антитіл до НІА-антигенів донора у си-

роватці реципієнта у крос-матч (cross-matching) реакції (принцип

описаний далі).

4. Якщо сироватка реципієнта не знищує донорських лімфоцитів

(або якщо донор і реципієнт є однояйцевими близнюками), засто-

совують реакцію змішаних лімфоцитів (MLR, mixed lymphocyte

reaction) для визначення стимуляції клітинами донора бластоутво-

рення лімфоцитів у реципієнта (принцип описаний далі).

Б. Визначення імунного статусу реципієнта. Він значною мірою зале-

жить від захворювання, що викликало необхідність трансплантації.

Наприклад, наявність автоантитіл при автоімунних захворюваннях

зумовлює відторгнення трансплантата навіть при повній сумісності

донора і реципієнта.

В. Визначення абсолютних і відносних протипоказань до трансплан-

тації. Серед основних причин — чинники, пов'язані з вираженою

декомпенсацією кількох життєво важливих органів чи систем (сер-

цево-судинної, дихальної та ін.), іноперабельні онкозахворювання,

активні інфекційні процеси. Так, реплікативна форма гепатиту В

вважається відносним протипоказанням до гепатотрансплантації, оскі-

льки в такому випадку відбувається реінфекція трансплантованої

печінки з наступною втратою її функції. Зрозуміло, що у випадку

пересадження органів (серце, нирка, печінка) недостатність їх попе-

редників вважається показанням, а не протипоказанням до транс-

плантації.

Антигени груп крові

У крові розрізняють аглютиногени А і В. Вони належать до най-

сильніших тканинних антигенів, оскільки представлені не тільки на

еритроцитах, але і на клітинах більшості тканин. А тому антитіла до

них (ізогемаглютиніни), відповідно, часто виявляються і повинні обо-

в'язково визначатися у реципієнтів.

Кров донора і реципієнта тестується в реакції аглютинації як на

визначення антигенів А і В, так і антитіл (гемаглютинінів).

Антигени тканинної сумісності

Забір клітин і сироватки крові для типування має певні особливос-

ті. Найкраще використовувати клітини з периферичної крові, лімфати-

чних вузлів, селезінки або тимусу. Вибір цих клітин обумовлений дво-

ма факторами: по-перше — доступністю для забору, по-друге — висо-

кою щільністю HLA-антигенів на їх поверхні.

Для HLA-типування найчастіше використовується сироватка крові

таких донорів:

— жінок, які багато разів вагітніли. Під час вагітності лімфоїдні

клітини плода, потрапляючи через плаценту в організм матері,

сенсибілізують її. Найвідомішим прикладом цього феномену є

резус-конфлікт. Поки що невідомі захворювання, пов'язані із се-

нсибілізацією до НІА-антигенів;

— пацієнтів, які отримували багаторазові переливання крові, сен-

сибілізуються чужими НІА-антигенами при кожній гемотранс-

фузії;

— добровольців, сенсибілізованих за допомогою гемотрансфузій,

введень лімфоцитів чи пересадження мікротрансплантатів.

Розрізняють дві групи методів, що різняться за принципом типу-

вання. До першого належать серологічний, клітинний та біохімічний

методи для виявлення продуктів НІА-молекул, експресованих на мем-

брані клітини. Методи другої групи — молекулярно-біологічні (амплі-

фікаційні) — визначають алелі НІА безпосередньо з геномної ДНК. У

клінічній практиці І класу НІА на сьогодні найчастіше вживаються се-

рологічний (лімфоцитотоксичний тест) та молекулярно-біологічний (по-

лімеразна ланцюгова реакція) методи. Основним принципом серологі-

чних методів (наприклад, лімфоцитотоксичного тесту) є ідентифікація

експресованих на мембрані молекул НІА за допомогою специфічних

антитіл.

Лімфоцитотоксичний тест призначений для ідентифікації НІА-ан-

тигенів І та II типів:

1. Очищені лімфоцити інкубуються з набором (панеллю) антисиро-

ваток з відомою НІА-специфічністю. Якщо в антисироватці є

антитіла до НІА-антигенів тестованих лімфоцитів, то вони фік-

суються до лімфоцитарної мембрани.

2. Після додавання комплементу ті лімфоцити, до яких зафіксува-

лися антитіла, руйнуються.

3. На наступному етапі додають синій трипан або еозин — барвни-

ки, що селективно абсорбуються лише пошкодженими або мер-

твими клітинами.

4. НІА-типування проводиться шляхом визначення тих комбінацій

"лімфоцити-сироватка", які зумовлюють руйнування клітин.

Недоліком методу є залежність від експресії молекули НІА на пове-

рхні клітини. Це стає на заваді типуванню при слабкій експресії або в

разі її відсутності, наприклад при лікуванні кортикостероїдами. У паціє-

нтів з гематоонкологічними захворюваннями, спадковими дефектами ди-

ференціювання та дозрівання клітин, а також після терапії цитостатика-

ми експресії може не бути. /Для багатьох алелів не існує специфічних

алоантитіл. Наприклад, із 249 описаних DRB1 алелів тільки 24 (менше

10 %) визначаються серологічно, тобто мають відповідні серотипи.

Ампліфікаційні методи. Полімеразна ланцюгова реакція забезпе-

чує набагато достовірніші результати і дає змогу ідентифікувати всі

відомі алелі кожного з локусів. Метод застосовують переважно для

визначення гістосумісності при трансплантації кісткового мозку, рід-

ше — нирок.

Існує 2 різновиди полімеразної реакції:

• із специфічними за послідовністю олігонуклеотидами;

• із специфічними праймерами.

Перший з них вважається надійнішим, проте для його проведення

необхідно від 1 до 3 діб. Другий різновид забирає усього 1-2 год. Ще

недано полімеразна ланцюгова реакція застосовувалася переважно для

наукових досліджень. Останнім часом вона знайшла широке застосу-

вання у клініці, особливо для вирішення спірних питань. Випробову-

ються нові ампліфікаційні методики, зокрема — лігазна ланцюгова

реакція.

Реакція змішаних культур лімфоцитів (MLR, mixed lymphocyte

reaction) застосовується для визначення більше 60 НІА-антигенів II класу,

кодованих D-локусом. Принципом методу є визначення мітотичної від-

повіді Т-клітин на чужі НІА-антигени. Так звані малі лімфоцити транс-

формуються у бластні клітини (бласттрансформація), які й виявляють-

ся у ході MLR. Розрізняють 2 варіанти цієї реакції: